ELECTROPHORESIS 4 rivelazione elettroforetica di DNA

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1 SOMMARIO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: +2 C +8 C USO PREVISTO pag. 1 PRINCIPIO DELLA METODICA pag. 2 DESCRIZIONE DEL KIT pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT pag. 3 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 CAMPIONI E CONTROLLI pag. 4 PROCEDURA pag. 5 LIMITI DELLA PROCEDURA pag. 10 CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI pag. 10 BIBLIOGRAFIA pag. 11 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 11 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 12 PRINCIPIO DELLA METODICA La procedura di rivelazione elettroforetica prevede la preparazione dei prodotti della reazione di amplificazione e il loro caricamento nei pozzetti del gel di agaroso immerso nel tampone di elettroforesi nella vaschetta elettroforetica. Applicando una corrente continua alla vaschetta elettroforetica il DNA presente in ciascun pozzetto migra verso l'elettrodo positivo ed incorpora il bromuro di etidio, un fluoroforo presente nel gel di agaroso. Il reticolo molecolare del gel di agaroso permette la separazione delle molecole di DNA di dimensioni più piccole, cioè con un numero di paia di basi (bp) minore, che migrano più velocemente, da quelle di dimensioni più grandi, cioè con un numero di paia di basi maggiore, che migrano più lentamente. Il DNA può essere visualizzato attraverso l'esposizione del gel ad una radiazione ultravioletta ed appare come una traccia arancione della forma del pozzetto (banda). La presenza del prodotto specifico di una indica la presenza del DNA bersaglio nel campione di partenza. DESCRIZIONE DEL KIT Il kit fornisce il Gel Pronto 8 pozzetti, in vaschetta e pronto all'uso, il Tampone di Elettroforesi 50x, da ricostituire con l'aggiunta di acqua bidistillata sterile, il Tampone di Caricamento 6x, per la preparazione dei prodotti della, il Marker HaeIII, come riferimento di peso molecolare. Il kit consente di effettuare 64 rivelazioni, pesi molecolari di riferimento e controlli compresi. MATERIALE INCLUSO NEL KIT Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura Gel Pronto 8 pozzetti Tampone di Elettroforesi 50x Tampone di Caricamento 6x gel di agaroso con 8 pozzetti in tampone TAE 1x con bromuro di etidio tampone TAE 50x, da diluire 50 volte con acqua tampone di caricamento, da diluire 6 volte nel campione 8 Agaroso, TRIS base, TRIS acetato, EDTA, 0,05% Bromuro di etidio 1 x 50 ml TRIS base, TRIS acetato, EDTA - 1 x 0,5 ml Glicerolo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA, Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF - - USO PREVISTO Il prodotto è un sistema di rivelazione ed identificazione del DNA mediante separazione elettroforetica su gel di agaroso dei prodotti dei saggi qualitativi di amplificazione degli acidi nucleici della serie «OligoMIX Alert kit» di ELITechGroup S.p.A. Marker HaeIII pesi molecolari di riferimento, pronti per l'uso 1 x 0,1 ml Plasmide, Glicerolo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA, Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF - Il prodotto trova impiego nella rivelazione dei risultati dei saggi qualitativi di amplificazione degli acidi nucleici per la ricerca di un DNA bersaglio nel DNA estratto da campioni biologici o nel cdna ottenuto da RNA estratto da campioni biologici. SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 1/12 SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 2/12

2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso in lattice o simili. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (2-20 µl, 5-50 µl). - Acqua bidistillata sterile. - Provette sterili da microcentrifuga da 1,5 ml. - Vaschetta elettroforetica. - Alimentatore a corrente continua (da 50 V a 150 V). - Transilluminatore UV (da 320 nm a 380 nm). - Apparato fotografico o sistema di acquisizione di immagine per la registrazione dei risultati. - Bromuro di etidio 0,05%. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'amplificazione del DNA o del cdna ottenuto dai campioni da analizzare, per il controllo positivo di amplificazione e per il controllo interno di idoneità non sono inclusi in questo kit. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori di ELITechGroup S.p.A.: serie «OligoMIX Alert kit», kit di amplificazione del DNA o del cdna ottenuto dai campioni; serie «Positive Control», controllo positivo di amplificazione di DNA plasmidico; «DECK» (codice DK100), controllo interno di idoneità che utilizza il gene umano della beta globina come bersaglio; il prodotto consente di effettuare 100 reazioni; «RECK» (codice RK100), controllo interno di idoneità che utilizza l'rna genomico del fago MS2 come bersaglio; il prodotto consente di effettuare 100 reazioni. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo kit è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel kit prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel kit durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del kit. Utilizzare solo i reagenti presenti nel kit e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da kit di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Il Gel Pronto 8 pozzetti è monouso e pertanto deve essere utilizzato una volta sola nella sessione di rivelazione. Il Gel Pronto 8 pozzetti deve essere conservato lontano da fonti di luce. Il Gel Pronto 8 pozzetti presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S 23-24/25. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. Campioni Il Tampone di Elettroforesi 50x presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. Il Tampone di Caricamento 6x presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. Il Marker HaeIII presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. CAMPIONI E CONTROLLI Il materiale da utilizzare con questo kit deve essere costituito da DNA prodotto da una reazione di amplificazione. Il DNA prodotto dalla deve avere dimensioni da 1000 bp a 50 bp per poter essere identificato con questo kit. SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 3/12 SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 4/12

3 Controlli di rivelazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di rivelazione facendo migrare sul gel di agaroso il Marker HaeIII, utilizzato come controllo positivo di rivelazione. E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della di un campione confrontando la sua migrazione su gel di agaroso con la migrazione del Marker HaeIII, utilizzato come riferimento di peso molecolare, e con la migrazione del prodotto della reazione di amplificazione del controllo positivo di amplificazione. PROCEDURA Preparazione del Tampone di Elettroforesi 1x Prima di iniziare la fase di rivelazione, preparare il volume di Tampone di Elettroforesi 1x necessario per la sessione di rivelazione elettroforetica secondo le seguenti istruzioni. Diluire 50 volte il Tampone di Elettroforesi 50x in acqua bidistillata sterile in modo da ottenere il Tampone di Elettroforesi 1x. Per esempio trasferire 10 ml di Tampone di Elettroforesi 50x in un contenitore sterile da 500 ml contenente 490 ml di acqua bidistillata sterile. Il Tampone di Elettroforesi 1x può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di tre mesi. Preparazione della sessione di rivelazione Per ciascun campione è richiesto l'utilizzo di 1 pozzetto. E' possibile eseguire 64 rivelazioni, pesi molecolari di riferimento e controlli compresi. Il numero minimo di rivelazioni per sessione è pari a 4, pesi molecolari di riferimento e controlli compresi. Prima di iniziare la sessione è necessario: - controllare, riferendosi alla documentazione dello strumento, le caratteristiche dell'alimentatore a corrente continua e le norme per un suo sicuro impiego da parte dell'operatore; - controllare, riferendosi alla documentazione dello strumento, le caratteristiche del Transilluminatore UV le norme per un suo sicuro impiego da parte dell'operatore; - stabilire la posizione dei pesi molecolari di riferimento, dei controlli e dei campioni nei pozzetti del gel e annotarla con cura su un Piano di lavoro. Il Piano di lavoro dovrà essere seguito con attenzione durante il trasferimento dei campioni nei pozzetti e servirà per la corretta interpretazione dei risultati. Allestimento dell'apparato elettroforetico 1. Verificare che l'alimentatore sia spento e che gli elettrodi siano scollegati dalla vaschetta elettroforetica. 2. Prelevare un vassoio di plastica contenente un Gel Pronto 8 pozzetti e togliere la protezione dalle due strisce adesive collocate sotto il vassoio. 3. Togliere la copertura che sigilla la parte superiore del vassoio con il Gel Pronto 8 pozzetti (Attenzione: il Gel Pronto 8 pozzetti contiene Bromuro di Etidio). 4. Sistemare il vassoio con il Gel Pronto 8 pozzetti nella vaschetta elettroforetica vuota fissandolo con le strisce adesive in modo che i pozzetti si trovino dalla parte della vaschetta elettroforetica con l'elettrodo negativo (nero). Nota bene: Per una separazione elettroforetica ottimale è indispensabile che il vassoio con il Gel Pronto 8 pozzetti sia sistemato in posizione perfettamente parallela all'asse lungo della vaschetta elettroforetica. 5. Riempire la camera elettroforetica con il Tampone di Elettroforesi 1x in modo che il suo livello superi di circa 5 mm i bordi del vassoio con il Gel Pronto 8 pozzetti in modo da permettere il passaggio della corrente elettrica nel gel. Preparazione del campione Nota bene: Quando nella sono stati utilizzati i controlli interni di idoneità «DECK» o «RECK» i campioni devono essere trasferiti direttamente nei pozzetti del gel senza aggiunta del Tampone di Caricamento 6x. Seguire pertanto la procedura descritta sotto, partendo dal punto Prelevare una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) per ciascuno dei campioni da analizzare, compresi i controlli di amplificazione, e una per i pesi molecolari di riferimento e marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile. 7. Trasferire nelle provette per microcentrifuga da 1,5 ml per i campioni da analizzare, compresi i controlli di amplificazione, 3 µl del Tampone di Caricamento 6x. 8. Prelevare 15 µl del Prodotto di amplificazione e trasferirli nella provetta per microcentrifuga da 1,5 ml con il Tampone di Caricamento 6x. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 15 µl nel Tampone di Caricamento 6x. Ripetere questa operazione per ciascun campione, compresi i controlli di amplificazione. 9. Trasferire nella provetta per microcentrifuga da 1,5 ml per i pesi molecolari di riferimento 10 µl del Marker HaeIII. Esecuzione della separazione elettroforetica 10. Verificare che l'alimentatore sia spento e che gli elettrodi siano scollegati dalla vaschetta elettroforetica. 11. Trasferire 18 µl di ciascun campione preparato (o direttamente di amplificato quando si usa il «DECK» o il «RECK») in un pozzetto del Gel Pronto 8 pozzetti, come registrato precedentemente nel Piano di lavoro. Nota bene: Trasferire con cura il campione preparato all'interno dei pozzetti in modo che si depositi sul fondo del pozzetto e che non debordi nei pozzetti adiacenti. 12. Trasferire 10 µl di Marker HaeIII nel pozzetto, come registrato precedentemente nel Piano di lavoro. 13. Chiudere la vaschetta elettroforetica con l apposito coperchio di sicurezza e connettere gli elettrodi: - elettrodo negativo (nero) dalla parte del gel con i pozzetti; - elettrodo positivo (rosso) dalla parte opposta del gel in cui avverrà la migrazione del DNA. Nota bene: Durante queste operazioni fare attenzione a non muovere bruscamente la vaschetta elettroforetica che possono causare la fuoriuscita dei campioni dai pozzetti. 14. Regolare sull Alimentatore la differenza di potenziale in modo che il campo elettrico risulti di 6-8 V / cm. Per esempio, se gli elettrodi della vaschetta elettroforetica distano circa 15 cm si consiglia di applicare una differenza di potenziale di V. 15. Accendere l'alimentatore e verificare che i coloranti del Tampone di Caricamento 6x migrino verso l'elettrodo positivo (rosso). (Attenzione: nell'apparato elettroforetico circola una corrente elettrica). 16. Condurre la separazione elettroforetica fino a quando il fronte di migrazione del colorante blu del Tampone di Caricamento 6x ha raggiunto circa un terzo della lunghezza del Gel Pronto 8 pozzetti, di norma sono sufficienti circa minuti (Attenzione: nell'apparato elettroforetico circola una corrente elettrica). 17. Spegnere l Alimentatore, attendere 10 secondi, quindi disconnettere gli elettrodi e rimuovere il coperchio della vaschetta elettroforetica. Nota bene: Il Tampone di Elettroforesi 1x può essere utilizzato per un massimo di 4 distinte sessioni di rivelazione elettroforetica entro due giorni conservandolo nella vaschetta elettroforetica chiusa. Nota bene: Il prodotto della è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare il prodotto della residuo, i gel già utilizzati, il Tampone di Elettroforesi 1x usato e gli altri scarti prodotti nella rivelazione elettroforetica. 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4 Rivelazione del DNA 18. Entro 30 minuti dalla fine della separazione elettroforetica prelevare il vassoio con il Gel Pronto 8 pozzetti dalla vaschetta elettroforetica quindi estrarre delicatamente il gel dal vassoio di plastica e trasferirlo sul Transilluminatore UV spento (Attenzione: il Gel Pronto 8 pozzetti contiene Bromuro di Etidio). Nota bene: Il prodotto della è in grado di contaminare i saggi successivi. Evitare la contaminazione dell'ambiente con il Tampone di Elettroforesi 1x. 19. Accendere il Transilluminatore UV per visualizzare nel gel la separazione elettroforetica del DNA e procedere alla registrazione dei risultati con un apparato fotografico o con un sistema di acquisizione di immagine (Attenzione: le radiazioni ultraviolette sono pericolose per la pelle e per gli occhi: evitare l'esposizione diretta o indiretta degli occhi e della pelle alla radiazione ultravioletta). Nota bene: Il Gel Pronto 8 pozzetti contiene bromuro di etidio, pertanto normalmente non è necessaria alcuna procedura di colorazione per evidenziare il DNA. Qualora il segnale fluorescente fosse poco visibile è possibile intensificarlo procedendo come descritto di seguito: a) in una vaschetta dedicata aggiungere a 100 ml di Tampone di Elettroforesi 1x un volume di 50 µl di Bromuro di etidio (non fornito nel kit) e mescolare bene; b) immergere per 30 minuti il gel senza il vassoio di plastica nel Tampone di Elettroforesi 1x e, se possibile, mantenerlo in agitazione lenta su di un piano basculante; c) trasferire il gel sul Transilluminatore UV e seguire la procedura dal punto 19. Interpretazione dei risultati La separazione elettroforetica del Marker HaeIII è utilizzata per convalidare la sessione di rivelazione come descritto nella tabella seguente: Marker HaeIII Bande visibili Rivelazione CORRETTA Se le bande del Marker HaeIII non sono visibili, si sono verificati problemi nella fase di rivelazione (problemi di trasferimento nel gel, di migrazione o di fluorescenza) che possono causare risultati falsi negativi. La sessione di rivelazione non è valida e deve essere ripetuta. La separazione elettroforetica relativa ad un campione in analisi è utilizzata per valutare la presenza e stimare le dimensioni e quindi la specificità del prodotto di una. Questo kit è in grado di rivelare una quantità minima di DNA prodotto della reazione di amplificazione di almeno 5 ng (limite di rivelazione del prodotto, vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 10). I risultati relativi a ciascun campione sono utilizzati per la ricerca del DNA prodotto della reazione di amplificazione, come descritto nella tabella seguente: Banda visibile DNA prodotto dalla PRESENTE E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione dei pesi molecolari di riferimento del Marker HaeIII e con la migrazione del prodotto della di controllo positivo. Questo kit è in grado di risolvere molecole di DNA prodotto della di dimensioni da 1000 bp a 50 bp (intervallo di separazione del prodotto, vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 10). I risultati relativi a ciascun campione sono utilizzati per la ricerca del DNA prodotto della reazione di amplificazione, come descritto nella tabella seguente: Migrazione del DNA prodotto dalla Corretta rispetto al Marker e al Controllo Positivo Errata rispetto al Marker e al Controllo Positivo DNA prodotto della SPECIFICO ASPECIFICO La presenza del prodotto specifico della indica la presenza del DNA bersaglio nel campione di partenza come descritto nella tabella seguente: DNA prodotto dalla Risultato della rivelazione elettroforetica Risultato del saggio DNA bersaglio nel campione di partenza PRESENTE e SPECIFICO positivo positivo PRESENTE PRESENTE ma ASPECIFICO negativo negativo NON RIVELATO NON RIVELATO negativo negativo NON RIVELATO L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della non ha alcun significato per quanto riguarda la ricerca del DNA bersaglio nel campione di partenza. Il significato della presenza del DNA bersaglio nel campione di partenza è descritto nei Manuali di istruzioni per l'uso dei prodotti della serie «OligoMIX Alert kit». Banda non visibile NON RIVELATO Se il risultato della separazione elettroforetica di un campione è Non Rivelato non si può escludere che il DNA prodotto della sia presente in quantità inferiore al limite di rivelazione del prodotto (vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 10). In questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 7/12 SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 8/12

5 A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta la separazione elettroforetica di una sessione di rivelazione dei prodotti della di 5 campioni. In questo esempio il prodotto della per il parametro di interesse ha dimensioni di 110 bp e il prodotto della del controllo interno di idoneità «DECK» o «RECK» ha dimensioni di circa 600 bp. Pozzetti Pesi Molecolari Controllo positivo Controllo negativo bp * * * * 459/434 bp 600 bp* 600 bp* 600 bp* 600 bp* 321/317 bp 293 bp 267 bp 250 bp 174 bp 142 bp 102 bp 110 bp 110 bp 110 bp 110 bp 80 bp * Utilizzando i sistemi «DECK» o «RECK», i campioni negativi per il prodotto della per il parametro di interesse presentano, se idonei, il prodotto di amplificazione del controllo interno di idoneità. Inoltre, con il «DECK» o il «RECK», anche i campioni positivi per il prodotto di amplificazione per il parametro di interesse possono presentare il prodotto di amplificazione del controllo interno di idoneità. Legenda della figura: - Pesi Molecolari, il Marker HaeIII presenta bande di dimensioni da 587 bp a 80 bp. - Controllo positivo di amplificazione, è presente il prodotto specifico di amplificazione per il parametro di interesse di dimensioni di 110 bp. - Controllo negativo di amplificazione, non è presente alcun prodotto di amplificazione. - Campioni 1 e 2, campioni positivi, sono presenti il prodotto specifico di amplificazione per il parametro di interesse e il prodotto specifico di amplificazione del controllo interno di idoneità. - 3, campione in cui non è rivelato il prodotto specifico di amplificazione per il parametro di interesse ed è presente solo il prodotto specifico di amplificazione del controllo interno di idoneità. - 4, campione positivo, è presente il prodotto specifico di amplificazione per il parametro di interesse (il prodotto specifico di amplificazione del controllo interno di idoneità in questo caso è assente). - 5, campione in cui non è rivelato il prodotto specifico di amplificazione per il parametro di interesse (è presente un prodotto aspecifico di amplificazione) ed è presente il prodotto specifico di amplificazione del controllo interno di idoneità. LIMITI DELLA PROCEDURA Utilizzare con questo prodotto soltanto il DNA prodotto da reazioni di amplificazione degli acidi nucleici. I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta raccolta, trasporto, conservazione, preparazione, estrazione e amplificazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite. Questo prodotto richiede personale addestrato alla manipolazione di preparati chimici per evitare incidenti con conseguenze per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e aree di lavoro adeguate alla manipolazione di preparati chimici per evitare incidenti con conseguenze per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede personale addestrato per le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici per evitare risultati falsi positivi nelle analisi successive con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle analisi successive con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle analisi successive con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Un risultato negativo ottenuto con questo prodotto indica che il DNA prodotto della reazione di amplificazione non è stato rivelato nella separazione elettroforetica ma non si può escludere che il DNA sia presente in quantità inferiore al limite di rivelazione del prodotto (vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 10); in questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un rischio residuo di ottenere risultati falsi negativi con questo prodotto. Questo rischio residuo non può essere eliminato o ridotto ulteriormente. Questo rischio residuo in situazioni particolari può contribuire a decisioni errate con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Sensibilità analitica: limite di rivelazione CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI La sensibilità analitica di questo sistema di rivelazione, come limite di rivelazione, permette di accertare la presenza di circa 5 ng di DNA nel prodotto della. La sensibilità analitica è stata verificata utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA plasmidico la cui concentrazione iniziale è stata misurata spettrofotometricamente. Il DNA plasmidico è stato digerito con l'enzima di restrizione Hinf I che dà origine a diversi frammenti tra i quali un frammento di dimensioni di 247 bp che rappresenta il 7,7% del DNA iniziale e ad un frammento di dimensioni di 75 bp che rappresenta il 2,3% del DNA iniziale. Un campione con una concentrazione di 100 ng di DNA plasmidico in 10 µl è stato impiegato in 2 replicati in diverse sessioni per eseguire la procedura di rivelazione. In tutti i replicati del campione sono risultati visibili il frammento di dimensioni di 247 bp, presente in una quantità di 7,7 ng, e il frammento di dimensioni di 75 bp, presente in una quantità di 2,3 ng. SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 9/12 SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 10/12

6 Sensibilità analitica: intervallo di separazione La sensibilità analitica di questo sistema di rivelazione, come intervallo di separazione, permette di risolvere molecole di DNA di dimensioni da 1000 bp a 50 bp nel prodotto della. La sensibilità analitica è stata verificata utilizzando come materiale di riferimento calibrato del DNA plasmidico la cui concentrazione iniziale è stata misurata spettrofotometricamente. Il DNA plasmidico è stato digerito con l'enzima di restrizione Hinf I che dà origine a diversi frammenti le cui dimensioni sono elencate di seguito: 1380 bp, 517 bp, 459 bp, 387 bp, 247 bp, 75 bp, 65 bp, 46 bp, 22 bp. Un campione con una concentrazione di 1 µg di DNA plasmidico in 10 µl è stato impiegato in 2 replicati in diverse sessioni per eseguire la procedura di rivelazione. In tutti i replicati del campione sono risultati risolti ed identificabili i frammenti di dimensioni da 1380 bp a 46 bp. Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "ELECTROPHORESIS", FTP EPH. BIBLIOGRAFIA T. Maniatis et al. (1987) Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor, NY: chapter 6 Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. LEGENDA DEI SIMBOLI Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Segnale molto debole o assente con il Marker Possibili cause Errore nella disposizione del gel nella vaschetta elettroforetica. Errore nella disposizione degli elettrodi nella vaschetta elettroforetica o nell'alimentatore. Errore nella dispensazione del Marker nel gel. PROBLEMI E SOLUZIONI Soluzioni I pozzetti devono trovarsi dalla parte della vaschetta elettroforetica con l'elettrodo negativo (nero). Collegare gli elettrodi nel modo corretto. Trasferire con cura il Marker all'interno dei pozzetti in modo che si depositi sul fondo del pozzetto. CONT Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Conservare lontano da fonti luce. Degradazione del Marker. Utilizzare una nuova aliquota di Marker. Fabbricante. Errore di impostazione dell'alimentatore. Errore di diluizione del Tampone di Elettroforesi. Separazione elettroforetica troppo lunga. Vassoio presente sul Transilluminatore UV. Controllare la differenza di potenziale impostata sull'alimentatore. Controllare la diluizione del Tampone di Elettroforesi. Interrompere la migrazione quando il colorante blu del Tampone di Caricamento ha raggiunto circa un terzo della lunghezza del gel. Togliere il gel dal vassoio di plastica prima di trasferirlo sul Transilluminatore UV. Degradazione del bromuro di etidio del gel. Ricolorare il gel come descritto nella sezione Procedura. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per la rivelazione di sequenze di acidi nucleici amplificate al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ad un prodotto licenziato per il "Positive Control" e per l'amplificazione di ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 11/12 SCH m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 12/12

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