DIAGNOSI DELLE INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE

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1 DIAGNOSI DELLE INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE Oliviero E. Varnier PP Slide Presentation by O E. Varnier! USD di Microbiologia IRCCS Hsan Martino. più di 100 virus sono noti per causare encefaliti acute nell uomo...

2 NEUROLOGO MICROBIOLOGO PAZIENTE INFETTIVOLOGO 2 di 25

3 INDICE! Encefaliti virali! Meningiti batteriche! Riattivazione di virus latenti 3 di 25

4 1. A. Giovanni 70 anni! Diagnosi clinica: encefalite! Liquor: 2 linfociti, proteine elevate, danno di barriera, bande oligoclonali addizionali in liquor e siero! Virologia: copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa 4 di 25

5 2. L. Paola 42 anni! Ricovero: sospetta encefalite! Liquor: 160 GB (80% linfo) proteine, glucosio normali danno di barriera, bande oligoclonali in liquor e siero! Virologica: copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor! Terapia: aciclovir iv, risoluzione clinica! Riflessioni: l esame liquorale standard quantifica la gravità dell encefalite. La PCR identifica l eziologia e indirizza la terapia 5 di 25

6 3. M. Ileana 27 anni! Ricovero: Sospetta meningite! Liquor: 20 GB (100% linfo), citochimico, immunochimico nella norma, bande assenti in liquor e siero! Virologica: 175 copie di VZV DNA/ml nel liquor! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa! Riflessioni: l esame liquorale standard identifica un lieve danno iniziale; la PCR identifica una lieve infezione virale e indirizza al trattamento specifico con risoluzione completa 6 di 25

7 4. C. Emanuela 19 anni! Cefalea ingravescente accompagnata da nausea, vomito e rigidità nucale.! Pronto soccorso: EEG e TAC negative! Liquor: 230 linfociti, danno di barriera, assenza di bande oligoclonali su liquor e siero all immunoblot! Virologia: anticorpi antivirus assenti 4,800 copie di VZV DNA/ml nel liquor! Terapia con aciclovir iv e valaciclovir per os! Rapida guarigione senza sofferanza assonale del facciale e conseguente deficit funzionale.! Diagnosi: meningite in sindrome di Ramsay Hunt paucisintomatica con riattivazione di VZV 7 di 25

8 5. M. Francesca 23 anni ID Data Diagnosi Clinica HSV 1 HSV 2 VZV CMV EBV HHV Sindrome Cerebrale NEG NEG NEG NEG NEG NEG Sindrome Cerebrale NEG NEG NEG NEG 700 NEG! A 5 anni, sindrome linfoistocitica post infezione da EBV! A 17 anni, sindrome cerebellare subacuta con probabile riattivazione di EBV! Terapia: Rituximab! Nel gennaio 2005 ospedalizzata: quadro clinico invariato.! Liquor: 3 linfociti, es citochimico, immunochimico normali, bande oligoclonali assenti in liquor e siero.! Virologia: 700 copie di EBV DNA/ml nel liquor! Diagnosi: ematofagocitosi maligna con infezione cronica da EBV e cerebellite subacuta ricorrente! Trapianto di Midollo 8 di 25

9 6. S. Gabriele 54 anni! Ricovero: lievo sindrome psicorganica, turbe espressione verbale, cefalea! TAC encefalo e doppler TSA nella norma; EEG: alterazioni discrete temporale sx! Liquor: completamente negativo! Virologia: copie BKV DNA/ml nel liquor! Terapia: nessuna! Risoluzione completa del quadro clinico e normalizzazione dell EEG in circa 72 ore! Diagnosi:?! Riflessioni: interdisciplinarietà! Possibile errore diagnostico da contaminazione del campione 9 di 25

10 7. donna 69 anni! Ricovero: stato confusionale e febbre elevata! Liquor: 100 cellule (90% linfociti), glucosio e proteine non alterate v Virologica: 80,000 HSV1 DNA copie per ml v Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa 10 di 25

11 RealTime PCR: LightCycler include amplificazione (PCR), ibridizzazione e il rilevamento del segnale in una singola fase in Real Time 11 di 25

12 LightCycler Real Time PCR: Piattaforma Sequenza DNA bersaglio cdna Primer Biotina cdna Biotina Primer rtth DNA Polimerasi Biotina cdna Biotina NEO AMPLICONE 12 di 25

13 LightCycler Real Time PCR: Rapidità min 02:48 9 Cicli in min 08:38 min 05:50 13 di 25

14 LightCycler Real Time PCR: Accuratezza, Intervallo di Calcolo, Linearità 14 di 25

15 LightCycler Real Time PCR: Analisi delle Curve di Melting tipo 1 AMPLICON tipo 2 tipo 1 tipo 2 AMPLICON tipo 2 tipo 1 15 di 25

16 LightCycler Real Time PCR: Virus BKV VZV CMV 16 di 25

17 Virus HSV1/2 ID Primers & Probes Tm HSV pol f TCgAgTgCgAAAAAACgTTC 57,4 C HSV pol a CggTTgATAAACgCgCAgT 58,9 C Light Cycler REALTIME PCR HSV-2 3FL gcgcaccagatccacgcccttgatgagc X 76,2 C HSV-2 5LC CTTgCCCCCgCAgATgACgCC p 71,6 C VZV 29F TgTCCTAgAggAggTTTTATCTg 52,8 C 29R CATCgTCTgTAAAgACTTAACCAg 53,8 C 29FLU gggaaatcgagaaaccaccctatcggac X 68,1 C 29LCR LC-AAgTTCgCggTATAATTgTCAgTggCg p 65,2 C CMV gb For ATAggAggCgCCACgTATTC 57,6 C gb Rev TACCCCTATCgCgTgTgTTC 57,1 C gb 3FL CgTTTCgTCgTAgCTACgCRTACAT X 62,0 C gb 5LC LC-ACACCACTTATCTYCTgggCAgC p 59,4 C EBV EB-30 gagggtggtttggaaagc 54,9 C EB-40 AACAgACAATggACTCCCTTAg 54,0 C EBNA 3FL AgTCgTCTCCCCCTTTggAATggC X 64,9 C EBNA 5LC LC-CTggACCCggCCCACAACTg ph 69,9 C HHV-6 101K-01 ACCCgAgAgATgATTTTgCg 52,8 C 101K-02 gcagaagacagcagcgcgat 53,8 C 101K-LC TAAgTAACCgTTTTCgTCCCA X 68,1 C 101K-FL LC-gggTCATTTATgTTATAgACggTg p 65,2 C 17 di 25

18 LightCycler Real Time PCR: RICERCA di 11 VIRUS DIVERSI in CAMPIONI di LIQUOR 224 liquor analizzati 1287 test eseguiti 33 campioni positivi 18 di 25

19 QUANTIFICAZIONE? 33 INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE 19 di 25

20 AD OGGI! Abbiamo sperimentato protocolli diagnostici di LightCycler Real Time PCR (incluso HHV-6 e HHV-8) da impiegare in parallelo in una unica seduta.! Gli acidi nucleici sono estratti dai campioni (liquor, sangue, urine, biopsie, ecc., purificati ed eventualmente concentrati in meno di 60 min! Ogni campione può essere analizzato per la presenza di sei herpesvirus umani (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e HHV-6) in circa 60 min. La presenza di DNA virale può essere quantificata ed espressa come copie di DNA per ml.! Lo stesso campione può essere testato anche per HHV-8, Poliomavirus (JCV e BKV) e Adenovirus.! In circa min dall arrivo del campione, i risultati sono comunicati per telefono, inviati per (file pdf) e stampati per l invio cartaceo. 20 di 25

21 LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti Test LightCycler RealTime PCR per:! Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis! Tipizzazione di N. meningitidis A, B e C! Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae! Identificazione e quantificazione di Listeria monocytogenes! Identificazione di Mycobacterium spp! Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium! Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato! Tipizzazione di B.afzelii, B.garinii e B. burgdorferi sensu stricto 21 di 25

22 LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti 22 di 25

23 LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti 19 MARZO CAMPIONI 44 POSITIVI 23 di 25

24 SEPSI E MENINGITI BATTERICHE! marzo 2004 marzo 2007! 20 casi di sospetta meningite batterica e 2 di sepsi:! 12 maschi e 10 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni! 12 deceduti! Neisseria meningitidis è stata identificata in 11 pazienti: 6 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C! Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 8 pazienti.! 25 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi, ad esempio:! S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata! IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis! ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale 24 di 25

25 RIFLESSIONI CONCLUSIVE Disponibili le Conoscenze e le Biotecnologie per una Diagnosi Avanzata delle Infezioni Neurologiche! Identificazione! Tipizzazione! Quantificazione! Referto rapido in 1,5 6 ore 25 di 25