CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO

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1 CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO La citofluorimetria a flusso è una tecnica di misurazione multiparametrica di caratteristiche fisiche e/o chimiche condotta su cellule in sospensione all interno di un fluido di trasporto. Le cellule/particelle passano allineate attraverso un sistema di rilevazione ottico/elettronico. Il tipo di parametri attualmente rilevabili in citofluorimetria a flusso è molto ampio: volume e complessità morfologica delle cellule, contenuto di pigmenti, DNA, RNA, proteine, antigeni di superficie ed intracellulari, ph, flussi di Ca ++, etc. Aspetto peculiare della citofluorimetria a flusso strettamente connesso alla possibilità di analizzare contemporaneamente più fluorescenze è quello di raccogliere e memorizzare molti parametri per ogni singola cellula analizzata, parametri che correlati tra loro permettono di individuare e studiare sottopopolazioni (anche rare) di cellule. Alcuni citofluorimetri sono inoltre in grado di separare fisicamente, secondo criteri stabiliti dall utilizzatore, popolazioni cellulari raccogliendole sia in provette che su micropiastre.

2 PRINCIPI DI BASE All'interno della cella a flusso, grazie al principio di focalizzazione idrodinamica, le particelle vengono messe in fila una dietro l altra, grazie alla differenza di pressione tra il campione e il fluido di trasporto

3 Le particelle cosi disposte passano davanti al raggio laser di forma elittica, focalizzato in modo da colpire le cellule al centro del canale di conta formato dal fluido di trasporto

4 Colpite dal laser le particelle emettono diversi segnali: FS relativo alle dimensioni, SS relativo alla granularita, se le particelle sono marcate con una sostanza fluorescente, un colore, per identificare una certa popolazione In caso di impiego di più di una sostanza fluorescente, le diverse emissioni di colore vengono separate attraverso un sistema di filtri ottici, in modo da

5 poter analizzare separatamente tutte le diverse fluorescenze (FL1,FL2,FL3,FL4) I fotomoltiplicatori (PMT) trasformano i segnali luminosi in impulsi elettrici direttamente proporzionali alla luce raccolta. L'ampiezza del segnale viene misurata in volts (da 0 a 10), per dare una visione grafica il voltaggio viene trasformato in canali di conta (da 0 a 1023) Questo passaggio viene definito come conversione analogico-digitale

6 Gli impulsi convertiti incrementano la conta per ogni canale. Il diagramma delle conte rispetto ai canali fornisce l istogramma L istogramma può essere di tipo mono o biparametrico. Nel biparametrico due grandezze misurate sono simultaneamente visualizzate sull asse delle ascisse e delle ordinate. L asse Z riporta il valore delle conte

7 Sostanze fluorescenti Le sostanze fluorescenti o marcatori, hanno la capacità di assorbire certe lunghezze d onda quando vengo eccitate, e di emettere un altra lunghezza d onda diversa da quella di assorbimento. Tra le sostanze più diffuse in citometria abbiamo i fluorocromi, con i quali vengono coniugati gli anticorpi monoclonali in modo da poter identificare una determinata popolazione. Originariamente si lavorava prevalentemente con due fluorocromi, FITC (isoticianato di fluorescina) e PE (ficoeritrina) ai quali si sono aggiunti in tempi recenti i fluorocromi Tandem ECD (energy coupled dye) e PC5 (ficoeritrina cianina) I fluorocromi tandem si basano sul principio del trasferimento di energia da un fluorocromo all'altro attraverso un legame chimico. Tutti questi fluorocromi vengono eccitati con un laser ad Argon con una lunghezza d onda di 488nm. Le ripettive emissioni sono: FITC = 525 nm PE = 575nm ECD = 620nm PC5 = 675nm

8 Ioduro di Propidio sostanza fluorescente per la marcatura del DNA.