Gli stessi agenti e circostanze responsabili del danno cellulare inducono una reazione del tessuto connettivo vascolarizzato chiamata infiammazione.

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1 Infiammazione Caratteri generali Infiammazione acuta Mediatori chimici dell infiammazione Esiti dell infiammazione acuta Infiammazione cronica Effetti sistemici dell infiammazione

2 Infiammazione (definizioni e caratteri generali) Gli stessi agenti e circostanze responsabili del danno cellulare inducono una reazione del tessuto connettivo vascolarizzato chiamata infiammazione. L infiammazione consiste nella fuoriuscita di fluido (con proteine) e cellule (leucociti) dall interno dei vasi della microcircolazione, ed è mediata da fattori chimici (mediatori dell infiammazione). L infiammazione contrasta l agente lesivo e gli effetti del danno, avviando contemporaneamente il processo di riparazione. L infiammazione può essere acuta o cronica, a seconda della sua durata e delle sue caratteristiche. Sebbene sia essenzialmente protettiva, alcuni aspetti dell infiammazione possono essere dannosi.

3 Tessuto connettivo vascolarizzato: i protagonisti dell infiammazione

4 Acuta Infiammazione acuta e cronica breve durata (minuti, ore pochi giorni); caratterizzata da: - formazione di essudato (fluido contenente proteine plasmatiche) - migrazione leucocitaria (cellule: prevalentemente neutrofili). Cronica lunga durata (giorni mesi); caratterizzata da: - necrosi tissutale - fibrosi - angiogenesi (cellule: prevalentemente linfociti e macrofagi). Le modificazioni dell infiammazione sono guidate da fattori chimici di origine plasmatica e/o cellulare. Tali mediatori dell infiammazione possono agire da soli, in combinazione, e/o in sequenza. L infiammazione termina quando lo stimolo nocivo viene eliminato, e i mediatori vengono inibiti (o degradati).

5 normale La microcircolazione: condizione normale, e condizione di infiammazione acuta infiammazione acuta Principali manifestazioni dell infiammazione acuta Vasodilatazione e aumento di flusso (rossore e calore) Aumento della permeabilità vascolare (essudato, o edema infiammatorio) Migrazione leucocitaria

6 Infiammazione acuta: modificazioni vascolari e formazione dell essudato MODIFICAZIONI DEL CALIBRO MODIFICAZIONI STRUTTURALI MARGINAZIONE, ADESIONE, E MIGRAZIONE LEUCOCITARIA (vasocostrizione fugace) vasodilatazione Aumento del flusso sanguigno Aumento della permeabilità Fuoriuscita fluidi e proteine ESSUDATO INFIAMMATORIO

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8 Formazione dell essudato: principali meccanismi di aumento della permeabilità Contrazione cellule endoteliali - Venule - Mediatori vasoattivi (istamina, leucotrieni) - Comune, e di breve durata Danno diretto - Intero microcircolo - Tossine, agenti fisici e chimici - Comune, e di lunga durata

9 Danno indotto da leucociti - Venule - Risposta tardiva e duratura Formazione dell essudato: altri meccanismi di aumento della permeabilità Aumento transcitosi - Venule - VEGF Neoangiogenesi

10 Le cellule coinvolte nei processi di Marginazione, Adesione, e Migrazione attraverso la parete vascolare A, neutrofilo; B, eosinofilo; C, basofilo; D, monocita; E, linfocita.

11 Marginazione, rolling, adesione, e migrazione attraverso la parete vascolare L agente responsabile del danno e/o il danno stesso stimolano alcune cellule presenti nella zona di lesione (per es. macrofagi) a produrre molecole (citochine) capaci di modificare le proprietà delle cellule endoteliali. A loro volta, le EC esprimono segnali molecolari (molecole di adesione, e chemochine), che regolano l arrivo dei leucociti nella sede della lesione.

12 Marginazione, rolling, adesione, e migrazione attraverso la parete vascolare La migrazione dei neutrofili: - rotolamento, attivazione e adesione all endotelio; - attraversamento dell endotelio e della membrana basale; - chemiotassi verso la sede del danno. Molecole diverse per le diverse fasi del processo: - le selectine nel rotolamento; - le chemochine nell attivazione dei neutrofili e nell aumento dell avidità delle integrine; - le integrine nell adesione; - CD31 (PECAM-1) nella transmigrazione.

13 Molecole coinvolte nelle interazioni endotelio-leucocitarie ESAM, endothelial cell -selective adhesion molecule ; ICAM1, intercellular adhesion molecule 1; JAM, junctional adhesion molecule ; LFA1, lymphocyte function -associated antigen 1; MAC1, macrophage antigen 1; MADCAM 1, mucosal vascular addressin cell - adhesion molecule 1; PSGL1, P -selectin glycoprotein ligand 1; PECAM1, platelet /endothelial -cell adhesion molecule 1; PI3K, phosphoinositide 3-kinase; VCAM1, vascular cell -adhesion molecule 1; VLA4, very late antigen 4.

14 Le interazioni molecolari alla base del rolling selectina E (sotto stimolo infiammatorio) cellula endoteliale selectina P (sotto stimolo infiammatorio, presente anche sulle piastrine) PSGL1 ligando principale per tutte le selectine leucocita leucocita selectina L (espressa dalla maggior parte dei leucociti) L interazione PSGL1 - selectina L media le interazioni leucocitaleucocita (cattura di altri leucociti da parte di leucociti già aderenti all endotelio) PSGL1: P selectin glycoprotein ligand 1 (inizialmente descritto per selectina P)

15 Le interazioni molecolari alla base dell attivazione e dell adesione Molecola endoteliale (immunoglobuline) Recettore leucocitario (integrine) cellula endoteliale ICAM-1 VCAM-1 LFA-1 Mac-1 VLA-4 leucocita Cellule presenti nel sito della lesione (per es. macrofagi) producono citochine capaci di attivare le EC. Le EC esprimono chemochine, e le presentano sulla superficie luminale legate a glicosamminoglicani. Le chemochine (che possono anche essere rilasciate) interagiscono con specifici recettori dei leucociti: GPCRs (G protein-coupled receptors, anche noti come seven transmembrane receptors). Molto rapidamente (millisecondi), l attivazione di GPCRs determina modificazioni del citoscheletro dei leucociti, e la modificazione delle proprietà di interazione di molecole di adesione della famiglia delle integrine. Queste ultime (LFA, VLA) interagiscono fermamente con le molecole endoteliali ICAM e VCAM.

16 La migrazione transendoteliale Nel passaggio attraverso le venule postcapillari (ca. 15 min), i leucociti devono superare tre barriere: -le Cellule Endoteliali -la Membrana Basale (BM) -i Periciti. Il movimento può essere innescato da molecole chemiotattiche presenti nel lume; le stesse interazioni integriniche stimolano il movimento: le EC formano delle docking structures in cui il leucocita prende posto. Superamento dell endotelio Via paracellulare: Migrazione fra giunzioni interendoteliali. Molecole endoteliali coinvolte (PECAM, ICAM, ESAM). Via transcellulare: presente nel CNS e in vari scenari di infiammazione. I leucociti mandano protusioni di membrana dentro le EC, e si formano dei veri e propri canali. Superamento della BM e dei periciti La BM è fatta da due network proteici: le laminine vascolari (laminina 8 e 10) e il collagene tipo IV, connessi da interazioni con molecole di perlecan (proteoglicano eparin solfato) e nidogen-2. I leucociti passano in regioni a bassa espressione delle proteine della matrice (sono coinvolti in questo i periciti, che le sintetizzano assieme alle EC).

17 Principali meccanismi molecolari di regolazione dell adesione Ridistribuzione delle molecole di adesione sulla superficie cellulare endoteliale: Il processo si svolge in pochi minuti, importante nel determinare l iniziale rotolamento dei leucociti sull endotelio (ridistribuzione Sel P da istamina). Induzione di molecole di adesione sulla superficie cellulare endoteliale: Il processo richiede una neosintesi proteica e inizia dopo un intervallo di tempo di 1-2 h (sintesi di Sel E da TNF, IL- 1). Aumento dell affinità di legame: meccanismo particolarmente importante per il legame delle integrine.

18 Marginazione e Adesione

19 Infiltrato leucocitario nell infiammazione acuta. Neutrofili (A) e monociti (B) nell infiammazione del miocardio dopo necrosi ischemica

20 PMN neutrofili 60-70% dei leucociti circolanti Contenenti ca 2000 granuli/cellula: 1) granuli primari o azzurrofili: lisosomi con enzimi proteolitici, perossidasi, lisozima 2) granuli secondari o specifici : con lattoferrina, cobalofillina, lisozima) - Scarsa sintesi proteica e scarsa fosforilazione ossidativa, alte quantità di glicogeno per la glicolisi anaerobia (vita media < 24 h) - Programmati a uscire dai vasi in risposta a segnali chimici chemiotattici (provenienti da batteri, tessuti danneggiati, altre cellule infiammatorie). - Per l attività battericida, i neutrofili devono essere attivati e andare incontro al burst ossidativo durante il quale rilasciano enzimi, radicali liberi e PG (per questo considerati cellule secretorie).

21 monociti/macrofagi i monociti circolanti iniziano a migrare relativamente presto, e dopo 48 h rappresentano il tipo cellulare predominante nella maggior parte dei casi di infiammazione acuta. Il monocita circolante raggiunge il tessuto extravascolare, si trasforma in una cellula fagocitaria più grande, il macrofago che ha il potenziale di essere attivato, e così: - aumenta di grandezza, - ha un metabolismo più attivo, - contiene più enzimi lisosomiali, - ha in generale una più grande capacità di fagocitare e distruggere il materiale fagocitato.

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23 Pathogen-associated molecular patterns, (PAMPs) Strutture molecolari comunemente riscontrate su patogeni (in realtà sulla maggior parte dei microbi). - lipopolisaccaride, LPS (Batteri Gram-) - flagellina, acido lipoteicoico (batteri Gram+) - peptidoglicano (Gram+ e Gram-) - varianti di acidi nucleici (in genere virali): dsrna, CpG non metilati. Pattern Recogniton Receptors, (PRRs) Proteine cellulari che riconoscono PAMPs, fattori plasmatici indotti da PAMP, e segnali di sofferenza tessutale e cellulare. - recettori Toll-like (TLR1-TLR11): l interazione con gli specifici PAMP attiva le vie NFkB e MAPK, con produzione di citochine e chemochine coinvolte nell immunità innata e adattativa. - recettore del mannosio: riconosce carboidrati batterici, e innesca la fagocitosi

24 Chemiotassi Movimento dei leucociti in direzione di un gradiente chimico. Nell infiammazione, granulociti, monociti e linfociti rispondono agli stimoli chemiotattici con velocità diverse.

25 Agenti chemiotattici Agenti esogeni: prodotti batterici (peptidi con aminoacido terminale N-formilmetionina, lipidi. Agenti endogeni: 1) frazioni del sistema complemento (particolarmente C5a) 2) prodotti della via lipossigenasica (leucotriene B4, LTB4) 3) citochine (particolarmente quelle della famiglia delle chemochine, come IL-8).

26 Fagocitosi L accumulo di leucociti nel sito infiammatorio ha due principali conseguenze funzionali: - fagocitosi e - rilascio di enzimi. La fagocitosi avviene in tre fasi: 1) Riconoscimento e attacco della particella da ingerire da parte del leucocita 2) Ingestione della particella con formazione di un vacuolo fagocitico 3) Degradazione del materiale ingerito.

27 Fagocitosi - Riconoscimento e attacco Il riconoscimento della particella da ingerire dipende dalla presenza di opsonine sulla sua superficie, riconosciute da specifici recettori dei leucociti. Principali opsonine: - Frammento Fc delle IgG - C3b, il frammento opsoninico di C3 - Collectine, PRR solubili (plasmatiche) della superfamiglia delle lectine (MBL, lectina legante residui di mannosio e fucosio delle pareti batteriche; capace di attivare il sistema complemento). L interazione opsonina-recettore determina l attivazione del leucocita.

28 Fagocitosi

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30 RILASCIO DI MEDIATORI, E DANNO TESSUTALE INDOTTO DAI LEUCOCITI Oltre che liberarsi all interno del fagolisosoma, alcuni prodotti sono rilasciati nello spazio extracellulare. Per i neutrofili, le sostanze più importanti sono: 1) enzimi lisosomiali 2) ROS 3) prodotti del metabolismo dell ac. arachidonico (prostaglandine e leucotrieni). Nell insieme, questi prodotti: - alterano il microambiente (cellule e matrice) - amplificano gli effetti dello stimolo infiammatorio iniziale - ma contemporaneamente determinano danno endoteliale e danno tessutale.

31 Effetti indesiderati della reazione infiammatoria Sebbene sia essenzialmente protettiva, alcuni aspetti dell infiammazione possono essere dannosi. Se l infiltrato leucocitario diventa persistente e non controllato, può generare un danno tessutale a sua volta responsabile di - malattie acute (danno da riperfusione, asma, glomerulonefrite ), e - malattie croniche (artrite, asma, aterosclerosi, malattie polmonari croniche...).

32 Meccanismi di rilascio (incontrollato) di enzimi Fagocitosi con rigurgito e fagocitosi frustrata: transitoria apertura all esterno del vacuolo fagocitario prima della chiusura del fagolisosoma; le modificazioni di membrana non si completano per motivi meccanici Rilascio citotossico: fagocitosi di sostanze con attività membranolitica (cristalli di urati) Esocitosi: secrezione diretta dei granuli.

33 Disease Genetic Defects in Leukocyte Functions Defect Leukocyte adhesion deficiency 1 Leukocyte adhesion deficiency 2 Chronic granulomatous disease X-linked Autosomal recessive Myeloperoxidase deficiency Chédiak-Higashi syndrome Acquired Thermal injury, diabetes, malignancy, sepsis, immunodeficiencies Hemodialysis, diabetes mellitus β chain of CD11/CD18 integrins Fucosyl transferase required for synthesis of sialylated oligosaccharide (receptor for selectin) Decreased oxidative burst NADPH oxidase (membrane component) NADPH oxidase (cytoplasmic components) Absent MPO-H 2 O 2 system Protein involved in organelle membrane docking and fusion Chemotaxis Adhesion Leukemia, anemia, sepsis, diabetes, neonates, malnutrition Phagocytosis and microbicidal activity Data from Gallin JI: Disorders of phagocytic cells. In Gallin JI, et al (eds): Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, 2nd ed. New York, Raven Press, 1992, pp 860, 861.

34 Riassunto della infiammazione acuta L aumento del flusso sanguigno (dilatazione arteriolare e apertura del letto capillare) e della permeabilità vascolare determinano la formazione di essudato (fluido extravascolare ad alta concentrazione proteica). Le proteine plasmatiche lasciano i vasi principalmente a seguito dell allargamento delle giunzioni interendoteliali a livello venulare, o a seguito di un danno diretto sulle cellule endoteliali. I leucociti, prevalentemente neutrofili all inizio, aderiscono all endotelio mediante molecole di adesione (attivazione leucocitaria), attraversano l endotelio e migrano verso il sito di flogosi sotto l influenza di agenti chemiotattici. Arrivati nel sito infiammatorio, i leucociti attuano la fagocitosi dell agente che ha determinato la risposta infiammatoria, e distruggono l eventuale (micro)organismo responsabile. Durante la chemiotassi e la fagocitosi, i leucociti attivati possono rilasciare metaboliti tossici e proteasi nell ambiente extracellulare, così potendo determinare danno tessutale.