Vol. 42 N. 165 Gennaio-Marzo 2012

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1 Indirizzo mail: Direttore Generoso Andria, Napoli Redattore Capo Francesca Santamaria, Napoli Comitato di Direzione Andrea Biondi, Monza Antonio Cao, Cagliari Giovanni Cioni, Pisa Giovanni Corsello, Palermo Alberto Martini, Genova Pierpaolo Mastroiacovo, Roma Luigi Daniele Notarangelo, Boston Luca Ramenghi, Milano Fabio Sereni, Milano Riccardo Troncone, Napoli Comitato Editoriale Salvatore Auricchio, Napoli Eugenio Baraldi, Padova Sergio Bernasconi, Parma Silvano Bertelloni, Pisa Mauro Calvani, Roma Franco Chiarelli, Chieti Liviana Da Dalt, Padova Mario De Curtis, Roma Maurizio de Martino, Firenze Pasquale Di Pietro, Genova Alberto Edefonti, Milano Ciro Esposito, Napoli Renzo Galanello, Cagliari Carlo Gelmetti, Milano Achille Iolascon, Napoli Giuseppe Maggiore, Pisa Bruno Marino, Roma Eugenio Mercuri, Roma Paolo Paolucci, Modena Martino Ruggieri, Catania Franca Rusconi, Firenze Luigi Titomanlio, Parigi Pietro Vajro, Salerno Gianvincenzo Zuccotti, Milano Redazione e Amministrazione Pacini Editore S.p.A. Via Gherardesca, Pisa Tel Fax info@pacinieditore.it Stampa Industrie Grafiche Pacini, Pisa Abbonamenti Prospettive in Pediatria è una rivista trimestrale. I prezzi dell abbonamento annuo sono i seguenti: PREZZO SPECIALE RISERVATO A SOCI SIP: 20,00. Contattare: fax segreteria@sip.it Italia 60,00; estero 70,00; istituzionale 60,00; specializzandi 35,00; fascicolo singolo 30,00 Le richieste di abbonamento vanno indirizzate a: Prospettive in Pediatria, Pacini Editore S.p.A., Via Gherardesca 1, Pisa tel fax abbonamenti@pacinieditore.it I dati relativi agli abbonati sono trattati nel rispetto delle disposizioni contenute nel D.Lgs. del 30 giugno 2003 n. 196 a mezzo di elaboratori elettronici ad opera di soggetti appositamente incaricati. I dati sono utilizzati dall editore per la spedizione della presente pubblicazione. Ai sensi dell articolo 7 del D.Lgs. 196/2003, in qualsiasi momento è possibile consultare, modificare o cancellare i dati o opporsi al loro utilizzo scrivendo al Titolare del Trattamento: Pacini Editore S.p.A., Via Gherardesca 1, Pisa. Le fotocopie per uso personale del lettore possono essere effettuate nei limiti del 15% di ciascun fascicolo di periodico dietro pagamento alla SIAE del compenso previsto dall art. 68, commi 4 e 5, della legge 22 aprile 1941 n Le riproduzioni effettuate per finalità di carattere professionale, economico o commerciale o comunque per uso diverso da quello personale possono essere effettuate a seguito di specifica autorizzazione rilasciata da AIDRO, Corso di Porta Romana n. 108, Milano 20122, segreteria@aidro.org e sito web: www. aidro.org. Copyright by Pacini Editore S.p.A. Direttore Responsabile: Patrizia Alma Pacini Rivista stampata su carta TCF (Total Chlorine Free) e verniciata idro. Vol. 42 N. 165 Gennaio-Marzo 2012 Pacini Editore Medicina

2 INDICE numero 165 Gennaio-Marzo 2012 epatologia (a cura di Pietro Vajro) Presentazione Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro Claudio Veropalumbo, Pietro Vajro... 3 Malattia di Wilson: ancora una sfida diagnostica Giusy Ranucci, Antonietta Zappu, Maria Barbara Lepori, Raffaele Iorio e Georgios Loudianos Epatite autoimmune: una terapia non sempre facile Marco Sciveres, Francesco Cirillo, Silvia Nastasio, Giuseppe Maggiore OCULISTICA (a cura di Adriano Magli) Presentazione Attualità in oftalmologia pediatrica Lucia Ambrosio, Francesco Matarazzo, Patrizio Magliozzi, Luca Rombetto, Roberta Carelli, Adriano Magli La cataratta congenita: iter diagnostico-terapeutico Adriano Magli, Elena Piozzi, Eduardo Maselli, Giovanni Marsico, Francesco Matarazzo, Luca Rombetto Stato della chirurgia refrattiva in età pediatrica Adriano Magli, Antonello Iovine, Giovanni Marsico, Lucia Ambrosio, Luca Rombetto, Paolo Nucci Frontiere (a cura di Antonio Cao, Luigi D. Notarangelo, Achille Iolascon, Andrea Biondi) Traffico intracellulare di proteine COP dipendente: rilevanza nella patologia umana Roberta Russo, Maria Rosaria Esposito, Achille Iolascon tavola rotonda (a cura di Andrea Biondi) La Normativa Europea sui farmaci in età pediatrica Andrea Biondi... 55

3 Epatologia Le malattie del fegato e delle vie biliari sono cause comuni di malattia cronica in età pediatrica, colpendo circa uno ogni bambini. Molte forme sono congenite e possono essere causate da una varietà di anomalie genetiche, malformazioni strutturali e infezioni prenatali. Altre comuni a quelle dell adulto, come ad esempio le epatopatie croniche virali e autoimmuni o il coinvolgimento epatico di condizioni sistemiche quali la celiachia e l obesità presentano comunque diverse caratteristiche peculiari dell età pediatrica. Molte, se non trattate adeguatamente e tempestivamente, evolvono verso la fibrocirrosi epatica fino alla necessità di epatotrapianto. Le epatopatie esercitano molti effetti negativi non solo sulla funzione epatica del bambino ma anche su crescita, sviluppo e realizzazione intellettuale, sviluppo psico-sociale e interazioni familiari. La gestione ottimale richiede spesso un approccio globale e multidisciplinare guidato da specialisti che abbiano specifiche competenze epatologiche pediatriche. L epatologo pediatra svolge un ruolo critico nel fornire piani terapeutici completi, consulenze e secondi pareri, su basi di breve o di lungo termine. La diagnosi e la gestione della vasta gamma di disturbi epatobiliari del bambino può richiedere una varietà di esami sierologici, metabolici, molecolari, istologici, radiografici ed endoscopici. Gli epatologi pediatri devono pertanto saper interagire con anatomopatologi, genetisti e specialisti metabolici, radiologi, chirurghi pediatri, chirurghi, radiologi interventisti e altri ancora. Il coordinamento del piano di cura del paziente deve essere spesso sviluppato su base individuale, non esistendo due pazienti uguali. Ricerca e buona assistenza clinica vanno di pari passo. Un attivo programma di ricerca epatologica pediatrica è indispensabile per ottenere avanzamenti nella comprensione della patogenesi e nel trattamento dei problemi epatici del bambino, incluso lo sviluppo di nuove terapie più sicure e più efficaci. Spesso le esperienze mutuate dalla ricerca clinica nell adulto debbono essere sfruttate come apripista per velocizzare i processi di dose finding ed effectiveness. Questo numero di Prospettive in Pediatria contiene tre lavori di Epatologia Pediatrica che bene illustrano quanto detto sopra. Il primo contributo focalizza la gestione dell epatite virale cronica e fornisce al pediatra lo stato dell arte utile per il trattamento dei pazienti. Non trascurando tuttavia di presentare dati recentissimi su farmaci di nuova generazione che stanno già ora modificando radicalmente l armamentario terapeutico a disposizione nell adulto. Il secondo contributo è un Focus che discute in particolare i principali ostacoli legati alla corretta diagnosi clinica e di laboratorio della malattia di Wilson, indispensabile per evitare l inesorabile progressione del danno epatico e neurologico se non adeguatamente trattata. Le principali opzioni terapeutiche agiscono con diversi meccanismi e nessuna di esse è scevra da effetti collaterali che debbono essere ben noti al paziente per assicurasi una buona compliance. Il terzo contributo verte sull epatite autoimmune e tratta in particolare problemi ancora aperti quali il tipo di associazione iniziale dei farmaci standard, nonché i criteri per la loro discontinuazione. Gli Autori ci mostrano come il trattamento convenzionale con steroidi e azatioprina sia altamente efficace ma debbano essere protratto a lungo prima di tentare una sospensione. La ciclosporina come farmaco alternativo è parimenti efficace e ormai sufficientemente radicato nella pratica clinica. Pietro Vajro Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Salerno 1

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5 Gennaio-Marzo 2012 Vol. 42 N. 165 pp epatologia Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro Claudio Veropalumbo 1, Pietro Vajro 2 1 Dipartimento di Pediatria, Università degli Studi Federico II, Napoli 2 Cattedra di Pediatria, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Salerno Riassunto Le criticità relative all attuale gestione dell epatite virale sono molteplici. L alto numero di soggetti infetti nel mondo dimostra la persistente necessità di introdurre programmi di prevenzione efficaci. La scelta dei soggetti da trattare non è univoca, specialmente per quanto concerne l età pediatrica, per il decorso spesso indolente della patologia e gli alti tassi di sieroconversione spontanea. La nostra revisione della letteratura analizza i pro e i contro da tenere in considerazione nel momento in cui si decide di intraprendere la terapia farmacologica. Vengono riportate le più recenti evidenze relative ai farmaci attualmente disponibili per il trattamento. Infine sono elencati i dati su agenti terapeutici emergenti nell adulto, il loro meccanismo d azione nonché le evidenze disponibili sui vaccini preventivi e terapeutici. Summary Several emerging issues related to management of viral hepatitis have recently been discussed in the literature. The high number of infected individuals in the world demonstrates the persisting need for effective prevention programs. Selection of subjects to be treated is not univocal, especially for the pediatric age group where the disease course is often considered mild and spontaneous seroconversion rates are reported. Our review examines pros and cons to take into account when one considers to begin pharmacological therapy. We list the most recent evidences related to currently available drugs for treatment. Finally, data on novel possible therapeutic agents, with their mechanisms of action and available evidence on preventive and therapeutic vaccines, are presented and discussed. Introduzione Le epatiti virali (epatite virale B [HBV] e C [HCV]) continuano a costituire un problema di rilievo per la sanità mondiale nonostante l introduzione del vaccino contro il virus HBV. Il rischio di contagio per entrambe le condizioni nella popolazione italiana è ulteriormente aumentato anche in ragione delle adozioni internazionali e della crescente immigrazione da Paesi con elevata prevalenza (Giacchino et al., 2010). La nostra revisione descrive novità circa aspetti generali delle epatiti croniche da HBV e HCV, evidenziando le peculiarità che tali patologie assumono quando interessano l età pediatrica. Aspetto centrale è però quello relativo alla gestione terapeutica, e pertanto saranno approfonditi i principali approcci farmacologici a disposizione e gli aspetti ancora controversi ad essi correlati. Accanto ai farmaci tradizionali, in epoca più recente si stanno sviluppando nuove terapie che trovano il loro razionale nel blocco delle varie fasi del ciclo replicativo dei virus epatitici, alcuni dei quali già utilizzabili nella popolazione adulta, altri in attiva fase di sperimentazione clinica. Obiettivo All interno della revisione sarà fornita una rassegna delle nuove strategie terapeutiche basate sul miglioramento delle conoscenze relative al ciclo replicativo virale, con un aggiornamento sullo stato di evidenza disponibile. Metodologia della ricerca bibliografica È stata svolta una ricerca attraverso PubMed utilizzando termini chiave come: viral hepatitis treatment; interferon; PEG-interferon; ribavirin; lamivudine; new antiviral drugs; viral hepatitis, children, anche tra loro incrociati. Sono stati selezionati articoli originali, revisioni, revisioni sistematiche e linee guida più recenti. Epatite B (HBV) L epatite cronica da HBV (CHB) costituisce una delle principali cause di epatopatia nel mondo. Si stima che oltre 400 milioni di individui siano oggi ancora cronicamente infetti. Fino al 40% degli individui infetti svilupperà complicanze, inclusa l insufficienza epatica, la cirrosi scompensata e il carcinoma epatocellulare. L incidenza di quest ultimo è drammaticamente crollata nei Paesi endemici dove è stato introdotto il programma vaccinale (Chang, 2011). La modalità di trasmissione ha importanti implicazioni poiché c è più alto rischio di sviluppare CHB se l infezione è contratta in epoca perinatale o prescolare, in relazione ad una maggiore immaturità delle difese immunitarie che risultano meno capaci di eliminare il virus. Il rischio di sviluppare CHB dopo esposizione al contagio varia dal 90% nei nati da madri positive per l Hepatitis B e Antigen (HBe- Ag), al 25-30% nei lattanti e nei bambini infettatisi prima dei 5 anni, fino a meno del 5% nei bambini più grandi e negli adulti. Una volta infetto, l individuo può eliminare il virus oppure andare incontro alle 4 fasi della CHB, le cui principali caratteristiche sono riassunte in tabella I. Attualmente sono identificati 8 diversi genotipi di HBV (da A a H): i genotipi B e C sono più comuni in Asia, l A e il D sono più comuni in Europa e in India, l A e il C predominano negli Stati Uniti. Il genotipo dell HBV ha influenza sulla progressione della CHB: individui con genotipo A, B, D o F in genere sieroconvertono ad anti-hbe entro 3

6 C. Veropalumbo, P. Vajro Tabella I. Fasi principali della epatite cronica B (CHB) (modificato da Hoofnagle et al. 2007). Fase ALT Istologia HBV-DNA HBeAg HBsAg Immuno-tolleranza Normale o poco aumentata Minima attività. Scarsa fibrosi Livelli elevati ( copie/ml) Presente Presente HBeAg+ CHB Costantemente Aumentata Attiva con variabile fibrosi Livelli elevati ( copie/ml) Presente Presente HBeAg- CHB Aumentata, spesso fluttuante Attiva con variabile fibrosi Moderato, fluttuante ( copie/ml) Assente Presente Portatore inattivo Normale Inattiva con minima fibrosi Basso, indosabile (<10 4 copie/ml) Assente Presente Guarigione Normale Inattiva con scarsa fibrosi Indosabile nel siero Assente Assente l età di 20 anni, mentre individui con genotipo C sieroconvertono ad un età media di 47.8 anni (Jonas et al., 2010). Chi trattare in età pediatrica La maggior parte dei bambini con CHB sono in fase di immunotolleranza. La decisione circa il quando e come l intraprendere la terapia farmacologica rappresenta pertanto un aspetto ancora controverso, anche tenendo presente che la sieroconversione spontanea HBeAg - HBeAb su base annua si verifica nel 7-16% dei soggetti affetti. Le linee guida presenti in letteratura non fanno chiaro riferimento all età pediatrica (Alberti et al., 2011, Carosi et al., 2007, EASLD, 2009, Lok et al., 2009). Il razionale della terapia è quello di bloccare la replicazione virale, riducendo quindi anche l infettività, e prevenire le complicanze a lungo termine. Come nell adulto, anche in età pediatrica fattori predittivi di buona risposta al trattamento farmacologico sono la bassa attività replicativa, la bassa carica virale, l elevata attività citolitica ed istologica. Obiettivo terapeutico è quello di ottenere la negativizzazione dell HBeAg con livelli non rilevabili di HBV-DNA (EASLD, 2009, Lok et al., 2009). Incertezze circa l opportunità di iniziare la terapia derivano dalla osservazione che la maggior parte dei pazienti non trattati presenta malattia di grado lieve e che molti di quelli con patologia attiva vanno incontro a negativizzazione spontanea dell HBeAg entro i primi 20 anni di vita (Jonas et al., 2010, EASLD, 2009, Lok et al., 2009, Iorio et al., 2007). La terapia standard fino ad alcuni anni fa con interferone (IFN) ± priming con steroidi mostrava differenze poco significative del tasso di sieroconversione e negativizzazione dell HBV DNA rispetto ai controlli non trattati, determinando tuttavia una significativa accelerazione della stessa sieroconversione e negativizzazione dell HBV DNA (Vajro et al., 1996, Sokal et al., 1998, Bortolotti et al., 2000). Pur in assenza di linee guida formali, diversi esperti suggeriscono dei criteri in base ai quali scegliere se intervenire farmacologicamente o limitarsi alla sola sorveglianza clinico-laboratoristica e strumentale. È stato proposto che i bambini selezionati per il trattamento debbano essere quelli con i seguenti fattori predittivi di risposta: evidenza di CHB biochimicamente attiva (ALT >2 x v.n.), positività dell Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) per almeno 6 mesi e HBeAg+ e/o HBV DNA > IU/ml, e con infiammazione epatica severa all istologia (Shah et al., 2009, Giacchino et al., 2010, Jonas et al., 2010). I pazienti HBeAg+ con transaminasi ALT elevate devono essere osservati per almeno 12 mesi per valutare l evenienza di sieroconversione spontanea. In mancanza di tale evenienza, i pazienti possono essere considerati candidati alla terapia, preceduta da biopsia epatica che, in caso di riscontro di fibrosi e/o cirrosi, costituisce una ulteriore indicazione al trattamento immediato (Jonas et al., 2010). La Figura 1 riassume le suddette informazioni in una flow-chart di gestione semplificata. Figura 1. Proposta di flow-chart per la scelta del comportamento terapeutico con lo standard of care (SOC) therapy (Interferone / lamivudina) in pazienti pediatrici affetti da epatite cronica B (modificato da Jonas et al. 2010). Terapia standard Attualmente i farmaci approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per la terapia della CHB sono 7. Di questi solo 3 molecole (IFN α, lamivudina e adefovir) sono state sinora approvate per la CHB in età pediatrica: le loro principali caratteristiche, dati di efficacia ed effetti collaterali più frequenti sono riportati nella tabella II. Interferone α L IFN possiede proprietà antivirali, antiproliferative e immunomodulatorie. In età pediatrica una terapia di 24 settimane con IFN α 2b è stata associata ad una sieroconversione dell HBeAg nel corso del primo anno significativamente più rapida. Tuttavia i risultati a 5 anni di follow up sono paragonabili a quelli del gruppo di controllo. I pazienti trattati tuttavia mostrano una clearance di HBsAg significativamente superiore a quella dei controlli (Sokal et al., 1998). Sulla scorta dei dati disponibili per l epatite C, la terapia con IFN Pegilato (farmaco caratterizzato da maggiore maneggevolezza legata alla monosomministrazione settimanale), ancorché sostenuta da una scarsa esperienza in età pediatrica, appare essere una prospettiva interessante e promettente anche nel trattamento dei bambini con CHB (Jonas et al., 2010, Giacchino et al., 2010). Lamivudina La Lamivudina, analogo nucleosidico in grado di inibire la trascrittasi inversa dell HBV, è stata auspicata avere un ruolo terapeutico primario nella terapia della CHB in età pediatrica, grazie alla possibilità 4

7 Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro Tabella II. Trattamenti disponibili per l epatite cronica B in età pediatrica negli Stati Uniti (modificato da Ayoub et al. 2011). Farmaco Età Vantaggi Svantaggi Effetti collaterali Dosaggio Risposta (%) IFNα 2 aa No resistenza. Breve durata terapia (16-24 settimane) Lamivudina 2 aa Buona tolleranza. Somministrazione orale Adefovir 12 aa Buona tolleranza. Somministrazione orale. Efficace vs HBV resistente a lamivudina Somministrazione parenterale. Effetti collaterali Farmaco-resistenza comune Farmaco-resistenza meno comune della Lamivudina Sintomi influenzali, aplasia midollare, alopecia, ipotiroidismo. Rallentamento crescita Monitorare funzionalità renale 5-10 MU/m2 3 volte/settimana per 24 settimane 3mg/kg/die fino a 100 mg/die per 52 settimane Monitorare funzione renale 10 mg/die per 48 settimane di essere somministrata per via orale, anche se necessariamente in maniera ininterrotta. Uno studio multicentrico di 24 mesi nel bambino ha evidenziato che la lamivudina porta ad una sieroconversione in un terzo e in un quarto rispettivamente di 213 pazienti con CHB mai trattati precedentemente o precedentemente trattati con lo stesso farmaco. Il problema principale della terapia con lamivudina è tuttavia rappresentato dal rischio significativo di farmaco-resistenza (principalmente legata a mutazioni del locus YMDD del gene della trascrittasi inversa dell HBV): in questo studio mutazioni YMDD si sviluppavano in circa il 50% e nel 64% dei casi, rispettivamente (Sokal et al., 2006). Altri analoghi nucleotidici e nucleosidici Ad eccezione dell Adefovir, utilizzabile negli USA già in età pediatrica, diversi analoghi sono stati approvati dall FDA solo per la terapia della CHB dell adulto. Rispetto alla Lamivudina, questi farmaci appaiono di enorme interesse per il vantaggio di poter essere somministrati per via orale e per lunghi periodi inducendo una minore farmaco resistenza. Adefovir. Nel gruppo di età tra 2 e 19 anni, in uno studio pilota di sicurezza, efficacia e farmacocinetica, il farmaco non ha purtroppo mostrato effetto superiore al placebo nell indurre sieroconversione dell HBsAg: un anno di terapia con Adefovir determina sieroconversione dell HBeAg nel 12% dei pazienti trattati. Una volta raggiunta, la sieroconversione è duratura nella quasi totalità dei casi. Come per la Lamivudina, i pazienti HBeAg negativizzati richiedono trattamento per tutta la vita (Jonas et al., 2008). Sia nell adulto che nel bambino, i tassi di resistenza osservati sono tuttavia nettamente inferiori a quelli determinati dalla Lamivudina (0%- 29% a 1-5 anni di terapia) (Jonas et al., 2008, Akman et al., 2010). Entecavir. È un interessante analogo nucleotidico inibitore della polimerasi dell HBV superiore alla Lamivudina nell indurre soppressione di HBV DNA, nel miglioramento dell istologia epatica e nella normalizzazione delle transaminasi. L incidenza di resistenza appare particolarmente bassa, con un tasso del solo 1.2% dopo 5 anni. In USA è possibile utilizzare il farmaco a partire già dai 16 anni. Recentemente ne è stata valutata l efficacia e la sicurezza anche in età pediatrica, in bambini con CHB precedentemente trattati senza successo con IFN o Lamivudina o Adefovir da soli o in combinazione. Dopo 24 settimane di trattamento si otteneva una riduzione significativa dei livelli di HBV-DNA con scomparsa in circa il 90% dei bambini HBeAg negativi e nel 23% di quelli HBeAg positivi (Pawlowska et al., 2011). Il Tenofovir è un analogo nucleotidico strutturalmente correlato ma meno potente dell Adefovir. Emtricitabina. Analogo nucleotidico strutturalmente simile alla Lamivudina con rischio elevato di resistenza (13% dopo 2 anni di terapia). Le prospettive principali sono date dalla potente associazione con il Tenofovir nella forma di TRUVADA (Tenofovir 300 mg/emtricitabina 200 mg). È stato dimostrato che la resistenza alla Lamivudina o all Adefovir non influenzava l azione di TRUVADA. Telbivudina. Ultimo analogo nucleotidico approvato dalla FDA per il trattamento della CHB, la Telbivudina determina un tasso di sieroconversione dell HBeAg del 22% e 33% rispettivamente a 1 e 2 anni di terapia. Come l Emcitrabina, nella popolazione adulta è un farmaco efficace specie nel trattamento dell epatopatia scompensata da HBV. Futuri campi di ricerca Vaccino terapeutico Il razionale di un vaccino terapeutico, da utilizzare da solo o in associazione alla terapia farmacologica convenzionale dell HBV, è quello di stimolare la risposta immune in soggetti cronicamente infetti. Recenti studi hanno valutato la somministrazione di vettori contenenti la sequenza genica della regione pres (altamente immunogena) in pazienti di età superiore ai 15 anni, mostrando buona tollerabilità del vaccino ma incapacità, rispetto alla terapia farmacologica classica, di indurre sieroconversione (Cavenaugh et al., 2011). Una delle principali problematiche sembra essere legata all esaurimento della risposta T-mediata nei soggetti cronicamente infetti, che quindi hanno minore capacità di rispondere allo stimolo immunologico di un vaccino terapeutico. Recentemente il tentativo di incrementare l immunogenicità del vaccino terapeutico si è concretizzato mediante la somministrazione contemporanea di HBsAg e HBeAg ricombinanti (vaccino noto col nome di NASVAC), in corso di attuale sperimentazione di fase I su popolazione adulta (Michel et al., 2011). Epatite C (HCV) L infezione da HCV è una problematica di rilevo mondiale che coinvolge circa 180 milioni di persone. L infezione è in grado di determinare epatiti acute e croniche con possibile evoluzione cirrotica e sviluppo di cancro epatico. Esistono 6 genotipi maggiori e più di 5

8 C. Veropalumbo, P. Vajro 80 sottotipi con diversa prevalenza nelle aree mondiali. I genotipi 1a e 1b sono i più comuni in Europa e negli Stati Uniti e, insieme al 2, sono i più comuni in assoluto. Alcuni di essi, come il 2 ed il 3, sono caratterizzati da minore aggressività, migliore risposta alle terapie antivirali e maggiore possibilità di clearance spontanea (Bortolotti et al., 2008). La principale modalità di infezione in età pediatrica è oggi rappresentata dalla trasmissione verticale che rende conto del 60% dei casi di epatite C nel bambino (Resti et al., 2003). I fattori associati alla trasmissione verticale sono rappresentati da alto numero di copie di HCV-RNA materno (>10 6 copie/mm 3 ), coinfezione con HIV, travaglio prolungato (Mohan et al., 2010, Ruiz-Extremera et al., 2011). I polimorfismi del locus rs , accanto al gene dell interleuchina IL28B (recentemente studiati in relazione alla clearance virale post-terapia nei pazienti adulti) non sembrano essere implicati nella trasmissione verticale dell HCV. Il polimorfismo CC è tuttavia indipendentemente associato con la clearance spontanea sia dei bambini con genotipo-1 (Ruiz-Extremera et al., 2011) sia di quelli con genotipo 2 e 3 (Indolfi et al., Hepatology 2011). Indicazioni al trattamento Come per l epatite cronica B, anche nel caso dell infezione da HCV non c è unanime consenso su quali siano le categorie di pazienti pediatrici da trattare. I punti a favore del trattamento sono quelli di prevenire la possibile progressione della patologia, evitando le gravi sequele epatiche e riducendo il rischio di contagio nei confronti degli altri e la spesa sanitaria (Ward et al., 2011). D altra parte, l asintomaticità clinica e laboratoristico/ strumentale nella maggioranza dei pazienti, il costo e i potenziali effetti collaterali dei farmaci, la lentezza della progressione e la risposta non sempre favorevole dei pazienti con genotipo 1, inducono perplessità riguardo all inizio della terapia antivirale (Wirth et al., 2011). Considerando comunque che il 5% dei pazienti affetti in età pediatrica svilupperà epatopatia severa, esistono pressioni nel raccomandare l inizio del trattamento antivirale già in età pediatrica, almeno per i genotipi più favorevoli (Munir et al., 2010). Terapia standard: Interferone + Ribavirina. L Interferone α pegilato (Peg-IFN α), in combinazione con la Ribavirina (RBV), è attualmente raccomandato come terapia di prima linea (standard of care, SOC) dell epatite cronica C (Mohan et al., 2010). Il Peg-IFN α è in grado di potenziare la risposta immunitaria nei confronti dell HCV stimolando l attività fagocitaria dei macrofagi e l attività citotossica dei linfociti nei confronti delle cellule bersaglio infettate dal virus. La Ribavirina somministrata in associazione con l IFN è un analogo della guanosina in grado di inibire la sintesi dell HCV RNA mediante inibizione della RNA polimerasi dell HCV determinando, nella popolazione adulta, un tasso medio di sustained virological response (SVR), definita dalla scomparsa di HCV RNA a 24 settimane dalla sospensione della terapia di circa il 50% nei pazienti con genotipo 1 e di circa l 80% nei pazienti con genotipo 2 e 3 (Munir et al., 2010). In un ampio studio pediatrico l azione della terapia con Peg-IFN α + ribavirina ha determinato un tasso di SVR in oltre la metà dei pazienti con genotipi 1, 4, 5 e 6, ed in oltre il 90% dei genotipi 2 e 3 (Sokal et al., 2010). Le caratteristiche dei due farmaci sono riassunte nella tabella III. Terapia individualizzata Una recente acquisizione nella terapia dell epatite C nell adulto è quella dell individualizzazione della stessa (tailored therapy), modulabile in base a parametri predittivi di SVR (Tsubota et al., 2011). La SVR è definita dalla scomparsa di HCV RNA (ricercato mediante PCR qualitativa) a 24 settimane dalla sospensione della terapia. I parametri predittivi vengono convenzionalmente distinti in: fattori legati all ospite e fattori legati all HCV. Fattori legati all ospite. Come la clearance spontanea, anche la risposta al trattamento dei pazienti con genotipo 1 è stata recentemente associata al polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP) accanto al gene dell interleukina 28-B sul cromosoma 19, che codifica per IFNλ-3. Il locus di interesse è rs dove il polimorfismo di un singolo nucleotide determina diversità allelica (allele C o allele T). Il tasso di risposta alla terapia standard nei pazienti con HCV di genotipo 1 è superiore nei polimorfismi CC, rispetto ai CT e ai TT (Ghany et al., 2011). Non sono disponibili dati pediatrici; tuttavia l importanza di questo polimorfismo sembra essere plausibile anche nel bambino (Ruiz-Extremera A et al., 2011). Fattori correlati all HCV. Genotipo dell HCV, carica virale pretrattamento e risposta virologica iniziale sono importanti fattori predittivi di SVR. Come già accennato, i pazienti con genotipi 2 e 3 rispondono alla terapia meglio di quelli con genotipi 1 e 4. Inoltre, basse cariche virali basali sono elementi predittivi di successo terapeutico, così come la rapida negativizzazione dell HCV-RNA. Terapia guidata dalla risposta. Il concetto della correlazione tra la rapidità di scomparsa dell HCV RNA e il raggiungimento della SVR ha permesso di introdurre il concetto della terapia guidata dalla risposta. L early viral response (EVR) è la riduzione di HCV RNA > 2 log 10 rispetto ai livelli pre-terapia (EVR parziale) e la scomparsa (EVR completa) alla 12 settimana di terapia. In base a queste considerazioni (sinora validate solo nell adulto) pazienti con genotipo 1 e 4 con EVR completa possono vantaggiosamente ridurre la durata del trattamento già a 24 settimane rispetto alle 48 convenzionali. Viceversa, in soggetti che non raggiungono la EVR, la terapia dovrebbe essere prolungata fino a 72 settimane. Pazienti con genotipo favorevole (2 e 3) sono anch essi indirizzati al trattamento per una durata di 24 settimane. Quest approccio modulabile costituisce una prospettiva interessante per l età pediatrica, anche se non sono attualmente disponibili evidenze preliminari (Hu et al., 2010). Tabella III. Principali caratteristiche dei farmaci utilizzati nel trattamento della epatite C in età pediatrica (modificato da Wirth et al. 2011). SVR Genotipo 1 Genotipi 2-3 Dosi IFN α 0-76% IFN α + ribavirina 27-64% 36-53% >80% IFN 3 milioni U 3volte/settimana RBV 15mg/kg/die PEG IFNα-2b/a +ribavirina 44-59% >90% Peg IFN - 60 mg/mq/1volta/settimana RBV 15 mg/kg/die SVR = Sustained virological response; IFN Interferone; RBV= Ribavirina 6

9 Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro Future prospettive terapeutiche Nell adulto vi sono interessanti studi sul ruolo di diversi nuovi farmaci che agiscono sulle varie fasi replicative dell HCV, attualmente in diversi stadi di sperimentazione clinica (Fig. 2). Albinterferon. Si tratta di una proteina costituita da IFN α 2b geneticamente fuso ad albumina umana. Un trial nell adulto ha mostrato un efficacia dell Albinterferon paragonabile a quella del PegIFN α nell indurre SVR in soggetti affetti da epatite C. Grazie alla possibilità di essere somministrato ogni 2 settimane, l Albinterferon costituisce un alternativa interessante nel trattamento dell epatite C (Nelson et al., 2009), ed è particolarmente attraente per l età pediatrica. Nuovi antivirali anti HCV. Diversi farmaci, utilizzabili per via orale in associazione (triplice) con la terapia standard IFN+ribavirina, provvisti di meccanismo d azione diverso dall Interferone, si trovano attualmente in diverse fasi di sperimentazione clinica nell adulto, aumentando significativamente i tassi di negativizzazione dell HCV- RNA nel genotipo 1, e portando alla guarigione la quasi totalità dei pazienti con genotipo 2 e 3. La loro possibile applicazione anche in età pediatrica è pertanto fortemente auspicabile. La figura 3 illustra i loro possibili siti di attacco. Inibitori di proteasi NS3/4. La HCV NS3 serin proteasi e il cofattore NS4a favoriscono il clivaggio della poliproteina virale in 4 proteine non strutturali. L inibizione di questo sistema non solo inibisce la replicazione virale, ma favorisce l immunità innata impedendo il clivaggio del Toll-IL1- receptor domain (TRIF) e IFN-β promoter simulator (IPS-1). Due di questi inibitori (Telaprevir e Boceprevir) sono stati approvati per l immissione sul mercato nel maggio 2011 negli USA per il trattamento della popolazione adulta infetta da HCV. Il primo, somministrato in aggiunta alla SOC therapy incrementa la SVR di circa il 20% in pazienti mai trattati precedentemente (SVR fino al 75-80%) e di circa il 30% nei non responders con genotipo 1. Il secondo incrementa la SVR nei pazienti non trattati con genotipo 1 solamente per somministrazioni prolungate (Kwong et al., 2011). Entrambi i farmaci permetterebbero di ridurre considerevolmente anche la durata del trattamento. Tuttavia vanno segnalati effetti collaterali specifici, quali rash, anemia (talora necessitante l uso di eritropoietina e/o riduzione del dosaggio), prurito, nausea e diarrea per il primo, e anemia e disgeusia per il secondo. Inibitori di proteasi di 2 a e 3 a generazione sono attualmente in attiva fase di sperimentazione. Inibitori dell HCV polimerasi. La RNA polimerasi RNA-dipendente NS5B è responsabile della sintesi dell RNA virale. Gli inibitori di tale enzima sembrerebbero essere meno efficaci degli inibitori di NS3/4a, ma agiscono su un numero maggiore di genotipi inducendo pertanto un vantaggioso minore tasso di resistenza. Inibitori dell ingresso cellulare e dell assemblaggio virale. Una serie di molecole sembrano costituire nuove prospettive terapeutiche per Figura 2. Rappresentazione schematica delle varie fasi di sperimentazione clinica delle opzioni terapeutiche per l epatite C. 7

10 C. Veropalumbo, P. Vajro Figura 3. Fasi replicative del virus dell epatite C e possibili siti d azione dei nuovi farmaci antivirali (modificato da Wyless et al. 2010). a. L ingresso nella cellula può essere bloccato da anticorpi neutralizzanti. b. Il rilascio dell RNA virale attiva pathways endogeni dell interferone. c. L RNA all interno del ribosoma attiva l immunità innata. L ingresso è mediato dal sito di ingresso interno del ribosoma. d. Traduzione e processamento delle poliproteine richiedono proteasi NS3/NS4a e possono essere bloccati da inibitori delle proteasi (Boceprevir e Telaprevir, già in commercio negli USA). e. La trascrizione può essere inibita dal blocco della traduzione (inibitori delle proteasi), dall inibizione del legame tra RNA e polimerasi e complesso replicativo (inibitori ciclofillina) inibitori di NS5A/B (inibitori polimerasi) e inibendo l elicasi.(taribavirina in avanzata sperimentazione clinica in USA). f. L assemblaggio virale e la glicosilazione dell envelope possono essere inibiti da celgosivir e inibitori di NS5A. il prossimo futuro. Qui di seguito citiamo quelle la cui sperimentazione è in fase più avanzata (Fusco et al., 2011), rimandando inoltre alla figura 3 la visualizzazione dei loro siti di attacco. Civacir: pool di immunoglobuline derivate dal plasma di soggetti anti HCV positivi teso ad inibire l ingresso cellulare del virus, al pari degli inibitori della sintesi delle lipoproteine. Inibitori delle proteine NS5A e NS4B: la proteina NS5A è implicata nell assemblaggio delle componenti capsidiche virali, mentre NS4B, favorisce la formazione di vescicole dalla membrana della cellula infetta essenziali per costituire il complesso di assemblaggio virale. Analoga funzione inibitoria sembra essere svolta da Inibitori di HMG CoA reduttasi, della ciclofillina, e dell α-glucosidasi. Infine, gli Agonisti dei Toll like receptors potrebbero avere un ruolo nel potenziare la risposta immune nei confronti dell HCV. Taribavirina (TBV). È un analogo della guanosina che è selettivamente captato dal fegato ed è rapidamente convertito a Ribavirina da una adenosina deaminasi. La presenza di un gruppo carbossamidico ne ostacola l accumulo nei globuli rossi riducendo l incidenza dell anemia tipica invece della Ribavirina. Lo studio ViSER appena concluso ha confrontato l azione del Peg IFNα associato a RBV o TBV mostrando una minore capacità di indurre la SVR della terapia comprendente TBV, ma con il vantaggio di un numero nettamente inferiore di eventi emolitici propri della Ribavirina (Marcellin et al., 2010). Vaccino È un campo di ampio interesse. Il razionale è stimolare la risposta immune verso l HCV. Ad oggi le difficoltà sono dettate principalmente ancora dalle regioni ipervariabili del genoma virale codificanti per componenti dell involucro pericapsidico virale in grado di favorire la continua evasione del virus dalla risposta immune dell ospite. Attualmente sono oggetto di studio: 1. Vaccini preventivi in soggetti non infetti. Basano il loro razionale sulla stimolazione di una produzione anticorpale in grado di inibire l ingresso cellulare e favorire l eliminazione dell HCV dopo il primo contatto (Torresi et al., 2011). 2. Vaccini terapeutici in soggetti infetti, da soli o in associazione alla terapia antivirale, stimolerebbero una risposta immune al fine di accelerare il processo di siero conversione. Tra questi il GlobeIm- 8

11 Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro Figura 4. Previsione dei progressi terapeutici dell Epatite Virale Cronica da HCV. mune GI-5005 (costituito da Saccaromyces cerevisiae inattivato ed esprimente proteine virali verso cui viene stimolata la risposta anticorpale e cellulo mediata) e l IC41 (vaccino peptidico sintetico che risulta in grado di indurre risposta specifica mediante secrezione di IFN gamma da parte di cellule T CD4+ e CD8+). Vaccini basati su Epitopi di NS3 ristretti per HLA-A2 utilizzano NS3 modificata per stimolare una risposta specifica T mediata. Infine, Vaccini costituiti dal gene NS 3/4a, la cui espressione viene posta sotto il controllo di un promotore di CMV, hanno mostrato risultati promettenti in associazione a IFN e ribavirina nell indurre sieroconversione (Lapierre et al., 2011; Torresi et al., 2011). Conclusioni e prospettive per il futuro La gestione delle epatiti virali si presenta ancora ricca di problematiche sia per la scelta di se e quando intraprendere un trattamento farmacologico, sia per la scelta del farmaco da utilizzare, principalmente legate all ancora incerta definizione dei fattori predittivi di risposta a terapie talora inefficaci. I nuovi farmaci antivirali utilizzati nell epatite B, costituiti da analoghi nucleosidici e nucleotidici, sono caratterizzati da una minore farmaco-resistenza. Al momento l Adefovir è adoperato in età pediatrica a partire dai 12 anni negli Stati Uniti, mentre in Italia può essere utilizzato solo dopo la transizione all età adulta. Vaccini terapeutici continuano ad essere testati come possibile trattamento nei pazienti infetti da HBV, senza tuttavia mostrarsi fino ad ora efficaci. Nella terapia dell epatite C nel bambino, la SOC therapy rimane ancora l associazione duplice Peg IFN+Ribavirina. Le nuove prospettive terapeutiche necessarie specie per i genotipi sfavorevoli 1 e 4 sinora disponibili nell adulto, sono costituite da nuove forme coniugate di Interferone e dalla Taribavirina. L utilizzo di algoritmi guidati dai polimorfismi dell IL28B premetterà di modulare appropriatamente dosi e durata di SOC therapy nei soggetti con fattori predittivi sfavorevoli. Altre nuove stimolanti strategie terapeutiche spesso da utilizzare in associazione con la SOC therapy sono costituite dai farmaci attivi contro l ingresso cellulare dell HCV e contro le diverse fasi del ciclo replicativo virale. I risultati degli studi preliminari rendono fiduciosi che almeno alcuni di questi dotati di maggiore efficacia e/o minori effetti collaterali entrino rapidamente nell uso comune. Cocktail di questi moderni farmaci orali di nuova generazione, che potranno forse funzionare senza l associazione dell IFN, ed eventualmente anche della RBV, con maggiore efficacia, minori effetti collaterali, minore durata del trattamento, minore farmaco resistenza, sono attesi nel prossimo futuro (Fig. 4). Il ruolo di vaccini contro l HCV, sia in ambito preventivo che come strategia terapeutica in soggetti infetti, è uno dei campi di maggiore interesse. I risultati preliminari sulla popolazione adulta non forniscono ancora, tuttavia, prove concrete di efficacia. Box di orientamento Cosa si sapeva prima: Le epatiti virali costituiscono una problematica di rilievo in considerazione della crescita delle adozioni internazionali e della popolazione immigrata non vaccinata contro l epatite B o infetta, e dell assenza di un vaccino efficace per l epatite C. La scelta di intraprendere il trattamento in età pediatrica è ancora discussa, in considerazione dell evoluzione spesso non severa dei pazienti affetti da epatite C, e della elevata percentuale di pazienti affetti da epatite B che sieroconvertono spontaneamente. I farmaci attualmente utilizzati nel bambino sono pochi, non privi di effetti collaterali e responsabili di farmaco resistenza in un numero non trascurabile di pazienti. Cosa sappiamo adesso: La scelta della terapia farmacologica potrà essere determinata specie per l epatite C non solo dal genotipo virale e dalle caratteristiche laboratoristico/cliniche/ istologiche del paziente. Nuovi polimorfismi genici recentemente associati alla risposta alla terapia dei pazienti affetti da epatite C possono infatti guidare nell adulto una scelta terapeutica individualizzata. Inoltre nuovi farmaci, il cui meccanismo d azione è basato sulla inibizione delle diverse fasi replicative virali, sono attualmente studiati su popolazione adulta e auspicabilmente potranno essere testati anche nel bambino. 9

12 C. Veropalumbo, P. Vajro Box di orientamento (segue) Quali ricadute sulla pratica clinica: Le problematiche di resistenza e di efficacia potrebbero essere superate da nuove strategie terapeutiche, attualmente sperimentate nella popolazione adulta, sia per l epatite B che per l epatite C. Resta ancora controverso e comunque privo di evidenze un vantaggio da parte dei vaccini terapeutici nei confronti delle terapie tradizionali. Bibliografia Akman SA, Kose S, Halicioglu O. Lamivudine and adefovir resistance in children and young adults with chronic hepatitis B. Int J Infect Dis 2010;14:e Alberti A, Caporaso N. HBV therapy: guidelines and open issues. Dig Liv Dis 2011;43S:S57-S63. * Linee guida di gestione dell infezione da HBV nella popolazione generale. Non viene fatto esplicito riferimento alla gestione dell infezione pediatrica. Ayoub WS, Keeffe EB. Review article: current antiviral therapy of chronic hepatitis B. 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13 Terapia delle epatiti virali croniche 2012: presente e futuro of active viral replication in children with chronic hepatitis B infection. Pediatr Infect Dis J 1996;15: * Definisce il ruolo del priming con prednisone in pazienti affetti da epatite cronica B, risultato non più efficace del solo interferone alpha 2b nell indurre siero conversione. Accelerazione della siero conversione e-anti e. Ward JW, Lok AS, Thomas DL, et al. Report on a single topic conference on chronic viral hepatitis strategies to improve effectiveness of screening and treatment. Hepatology 2012;55: Wirth S, Kelly D, Sokal E, et al. Guidance for clinical trials for children and adolescents with chronic hepatitis C. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2011;52: ** Fornisce informazioni relative alla selezione dei pazienti pediatrici da trattare e alla tipologia dei farmaci attualmente adottati, proponendo nuove frontiere di ricerca. Wyles DL. Moving beyond interferon alfa: investigational drugs for hepatitis C virus infection. Top HIV Med 2010;18: ** Mette in relazione il meccanismo d azione dei nuovi potenziali farmaci per il trattamento dell epatite C con le fasi replicative dell HCV. Corrispondenza Pietro Vajro, Facoltà di Medicina e Chirurgia dell Università di Salerno, via Allende, Baronissi (SA). Tel. * pvajro@unisa.it 11

14 Aprile-Giugno Gennaio-Marzo Vol. Vol N. N Pp. pp. xx-xx Malattia di Wilson: ancora una sfida diagnostica nefrologia epatologia Giusy Ranucci *, Antonietta Zappu **, Maria Barbara Lepori **, Raffaele Iorio * e Georgios Loudianos ** *Dipartimento di Pediatria, Università di Napoli Federico II; ** Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Cagliari Riassunto La malattia di Wilson (MW) è un disordine autosomico recessivo, caratterizzato da una difettosa escrezione del rame a livello epatico, dovuta alla presenza di mutazioni, in omozigosi o eterozigosi composta, del gene ATP7B, localizzato sul cromosoma 13. In conseguenza dell accumulo di rame, la sintomatologia clinica si evidenzia principalmente a carico di fegato, sistema nervoso centrale e occhio. La maggior parte dei pazienti in età pediatrica presenta un epatopatia all esordio, mentre i sintomi neurologici e psichiatrici predominano nell età adolescenziale ed adulta. Le manifestazioni epatiche variano da forme pauci/asintomatiche con ipertransaminasemia e/o epatomegalia esclusive, a quadri di epatopatia cronica cirrogena o di epatite fulminante. Le manifestazioni neuropsichiatriche sono molteplici e talora, per la loro aspecificità, possono essere erroneamente interpretate. Esse includono alterazioni dell umore, deterioramento delle prestazioni scolastiche, deficit di coordinazione dei movimenti, disturbi della scrittura. Se la MW non viene riconosciuta e adeguatamente trattata, la progressione del danno può essere rapida ed inesorabile. Sfortunatamente la diagnosi di MW è molto impegnativa, nonostante i progressi in ambito biochimico e molecolare. Tutti i pazienti con MW, anche quelli in fase pre-sintomatica, devono essere avviati al trattamento farmacologico. Le principali opzioni terapeutiche sono la D- penicillamina, la trientina e lo zinco che agiscono con diversi meccanismi. Nessuno di tali farmaci è scevro da effetti collaterali. L educazione del paziente, l aderenza alla terapia e la diagnosi precoce dei possibili effetti collaterali dei farmaci sono i punti cardine per ottenere un successo terapeutico. Nell articolo saranno discussi i principali problemi dell approccio diagnostico. Summary Wilson disease (WD) is an autosomal recessive inherited disorder of copper excretion, caused by two disease-causing mutations or homozygosity for a single disease-causing mutation of the ATP7B gene, located on chromosome 13. The accumulation of copper results in symptoms involving particularly liver, brain and eye. Most of pediatric WD patients present with liver disease, whereas neuropsychiatric symptoms are more common in young adults. The hepatic clinical presentation ranges widely from asymptomatic hypertransaminasemia and/or hepatomegaly to cirrhosis and acute liver failure (ALF). The clinical neuropsychiatric symptoms are multiple and for their aspecificity sometimes misinterpreted. They include sudden behavioral changes, worsening in school performances, inability to carry out activities that need hand-eye coordination and modification in handwriting. If WD is not recognized and adequately treated, the progression of hepatic and neurologic damage can be very rapid. Therefore the prompt detection of this condition is vital. Unfortunately, the diagnosis of WD is an especially challenging task in spite of advances in biochemical and molecular knowledges. The first essential step in making the diagnosis is to think of it. All WD patients, also pre-symptomatic ones, need treatment. The currently available drugs are D-penicillamine, trientine and zinc, that act with different mechanisms. None of the available drugs is side-effect-free. The patient education, adherence to therapy and early detection of possible side effects of drugs are the cornerstones for a successful treatment. The critical issues related to the diagnostic approach of WD will be discussed. Introduzione La Malattia di Wilson (MW), descritta per la prima volta nel 1912 dal neurologo Americano Kinnear Wilson come degenerazione progressiva epatolenticolare, è un disordine genetico, trasmesso con modalità autosomica recessiva (Wilson S.A.K, 1912). La MW colpisce da 1 su a 1 su individui (Ala et al., 2007). Il gene responsabile della malattia codifica per una proteina di membrana (ATP7B), espressa primariamente nel fegato, il cui ruolo è quello di regolare il trasporto del rame (Tanzi et al., 1993). Mutazioni di questo gene causano un deficit di escrezione di rame nella bile e una sua difettosa incorporazione nella ceruloplasmina. La compromissione della normale escrezione del rame epatico dà luogo ad un accumulo di tale metallo primariamente nel fegato, dove può causare epatite e cirrosi. Successivamente, il rame viene rilasciato nel sangue e si deposita in altri organi, in particolare nel cervello, nella cornea e nei tubuli renali. Il fenotipo della MW è molto variabile, dipendendo da molteplici fattori tra cui l età e il genotipo. In età pediatrica la MW si manifesta spesso con un quadro di epatopatia. A prescindere dall età i segni clinici sono frequentemente non specifici, con l eccezione dell anello di Kayser-Fleischer che peraltro è di rara osservazione in età pediatrica. L eterogeneità dell espressività clinica e laboratoristica della MW spiegano perché la diagnosi sia molto impegnativa in età pediatrica se non si mantiene alto l indice di sospetto. Qualora non riconosciuta e opportunamente trattata, la MW può essere una potenziale causa di insufficienza epatica acuta con necessità di epatotrapianto in taluni casi (Roberts et al., 2008). Il successo terapeutico ottenuto utilizzando chelanti orali del rame e sali di zinco rende la MW una delle epatopatie metaboliche curabili. Quando adeguatamente trattata la MW ha una prognosi eccellente, con una curva di sopravvivenza che coincide con quella della popolazione generale (Bruha et al., 2010). Il trattamento della MW deve 12

15 Malattia di Wilson: ancora una sfida diagnostica Figura 1. Meccanismi che regolano il metabolismo del rame nell epatocita e ruolo dell ATP7B. Il rame viene transportato all interno dell epatocita dalla proteina di membrana CTR1. In seguito viene legato dal metallochaperone ATOX1 e viene transportato nella via secretoria mediante la proteina ATP7B. In condizione di normale concentrazione del rame intracellulare, l ATP7B è localizzata nella regione trans-golgi e determina il trasporto del rame all interno delle cisterne dove viene incorporato nell apoceruloplasmina, che diventa ceruloplasmina (Sezione A). In condizioni di eccesso del rame intracellulare, l ATP7B viene trasferita in forma vescicolare al polo canalicolare dell epatocita, dove determina l eliminazione del rame in eccesso (Sezione B). Quando la concentrazione del rame all interno della cellula si abbassa la proteina ATP7B ritorna nella regione trans-golgi. Nella Malattia di Wilson a seconda del tipo di mutazione si può avere: difettosa sintesi dell ATP7B, difettosa modifica post-trascrizionale dell ATP7B, difettosa localizzazione dell ATP7B nell epatocita, difettosa funzione dell ATP7B nel trasporto del rame, difettosa interazione proteina-proteina (ATP7B ed ATOX1). CTR1: Copper Transporter 1, ATOX1: ATX1 antioxidant protein 1 homolog (yeast), TGN: Trans-Golgi network, Cu:rame però essere proseguito per tutta la vita; infatti alla sospensione prolungata della terapia farmacologica segue inevitabilmente la morte per insufficienza epatica acuta. Patogenesi In condizioni fisiologiche il rame alimentare viene assorbito attraverso lo stomaco ed il duodeno ed arriva al fegato attraverso la vena porta, qui viene utilizzato per la sintesi di vari enzimi come costituente della molecola, mentre l eccesso viene eliminato attraverso le vie biliari (Tapiero et al., 2003). Il fegato ha un ruolo fondamentale nel metabolismo del rame perché costituisce il sito di conservazione di questo metallo e, in condizioni di eccesso, la via principale per la sua eliminazione attraverso le vie biliari. Ogni giorno viene eliminata con la bile una quantità di rame equivalente a quella assorbita, che ammonta a circa 2-4 g al giorno (Tapiero et al., 2003). Il ruolo essenziale del fegato nell omeostasi del rame é dimostrato dalla normalizzazione della sua omeostasi in pazienti con MW sottoposti ad epatotrapianto. L ingresso del rame negli epatociti avviene attraverso la membrana basolaterale ad opera di una proteina di membrana chiamata Ctr1. Dopo l ingresso, il rame viene immediatamente legato da diverse proteine, i metallochaperoni, e viene trasportato in diversi siti per il suo utilizzo (Tapiero et al., 2003). Quindi in condizioni fisiologiche la quantità di rame libero nel fegato é molto esigua. Tra i chaperoni, l Atox1 attraverso l interazione con la proteina ATP7B é essenziale per il trasporto del rame nella via secretoria (Fig. 1). Il gene che codifica per la proteina ATP7B é localizzato sul cromosoma 13q14-21, è costituito da 21 esoni e si estende in una regione genomica di circa 100kb. Esprime un RNA di 7.5 Kb soprattutto nel fegato, placenta, rene, ma anche nel cervello dove svolge un ruolo chiave nella regolazione della omeostasi del rame. La proteina che codifica, l ATP7B, appartiene alla famiglia dei trasportatori di metalli pesanti attraverso le membrane che utilizzano l energia liberata dall idrolisi del fosfato terminale dell ATP, e quindi vengono nominate P-type ATPasi (Bull et al., 1993; Tanzi et al., 1993; Petrukhin et al., 1994; Fig. 2). La proteina ATP7B è localizzata nella regione trans-golgi dove agisce portando il rame nella via secretoria per la sua incorporazione nell apoceruloplasmina che così diventa la forma matura e funzionante della ceruloplasmina (Lutsenko et al., 2002). In condizioni di aumento della concentrazione del rame intracellulare avviene una migrazione della proteina di Wilson in una regione citoplasmatica vicina alla membrana canalicolare, che poi ricicla di nuovo nella regione trans-golgi quando la concentrazione intracellulare del rame torna ad essere normale 13

16 G. Ranucci et al. Figura 2. Modello topologico proposto per la localizzazione della proteina ATP7B nella regione trans-golgi. Si distinguono 8 regione transmembra e diversi domini funzionali: MTCQSC: domini di legame del rame, ITGEA: dominio di transduzione, CPC: sito di legame del rame prima del ingresso nel canale degli ioni, TGTKD: dominio di fosforilazione, SEHPL: dominio altamente conservato sede della mutazione più comune p.h1069q, (l asterisco indica la posizione della mutazione). GDGVND: regione cerniera che connette jl dominio di legame dell ATP con la regione transamembrana 7. (Lutsenko et al., 2002). Nonostante sia ancora poco chiaro, si pensa che la migrazione della ATP7B costituisca il meccanismo per l eliminazione del rame in condizioni di eccesso. Quindi tutte quelle condizioni che portano ad un difetto di sintesi della proteina di Wilson, della sua corretta localizzazione nella regione trans-golgi e della sua capacità di trafficare in condizione di eccesso intracellulare di rame, si traducono da una parte in una diminuzione della sintesi della ceruloplasmina, dall altra parte in un accumulo di rame nella cellula con danno cellulare e conseguente rilascio del rame nel circolo che va a depositarsi e a danneggiare altri organi soprattutto il cervello. Aspetti clinici della MW Sebbene l alterata escrezione biliare del rame sia presente sin dalla nascita, i sintomi generalmente non si manifestano sino ai 3 anni, e raramente diventano evidenti prima dei 5 anni (Roberts et al., 2008). I possibili segni e sintomi associati alla MW sono mostrati nella Tab. I. Le principali presentazioni cliniche sono quella epatica e quella neuropsichiatrica. Analizzando i dati scaturiti dalla combinazione delle più ampie casistiche di pazienti con MW descritte in letteratura (O Connor et al., 2007), risulta che la maggior parte dei pazienti in età pediatrica si presenta con un quadro di malattia epatica, mentre i sintomi neuropsichiatrici sono più comuni nella tarda adolescenza e nel giovane adulto e ricorrono solo nel 4-6% dei pazienti pediatrici con esordio epatico (Iorio et al., 2004; Muller et al., 2007). Paragonando la percentuale dei pazienti con MW con esordio epatico rispetto a quelli con esordio neurologico, essa risulta rispettivamente dell 83% vs 17% prima dei 10 anni, 52% vs 48% tra i 10 e i 18 anni, 24% vs 75% dopo i 18 anni (O Connor et al., 2007). Nel bambino l epatopatia può manifestarsi con molteplici quadri: ipertransaminasemia asintomatica, epatomegalia isolata con eventuale presenza di steatosi all esame ecografico, epatite acuta itterica tipo epatite virale acuta, epatite fulminante, epatopatia cronica cirrogena con variabile grado di insufficienza epatocellulare ed eventuali segni di ipertensione portale e sue complicanze. In età pediatrica, la percentuale dei bambini con MW diagnosticata in seguito al riscontro occasionale di ipertransaminasemia varia dal 14% all 88%, a seconda delle aree geografiche (Nicastro et al., 2010; Dhawan et al., 2005; Iorio et al., 2004; Sanchez et al., 1999). In Italia è particolarmente alta la percentuale dei casi di MW riferiti per ipertransaminasemia isolata in conseguenza dell estensiva valutazione delle transaminasi nel contesto di check-up anche in assenza di specifiche indicazioni (Iorio et al., 2004). Le manifestazioni neurologiche si presentano tipicamente durante l adolescenza o nella terza decade di vita (Ala et al., 2008). I quadri di presentazione neurologici sono stati classificati in tre sottogruppi: sindrome acinetica-rigida simile alla malattia di Parkinson, caratterizzata da bradicinesia, alterazioni cognitive, disturbi dell umore; pseudosclerosi caratterizzata da atassia e tremori con lesioni focali Tabella I. Modalità di presentazione della MW (da Ala et al., 2007; Roberts et al., 2008, modificato). Epatica Ipertransaminasemia Epatomegalia Fegato brillante all esame ecografico Epatite acuta Psichiatrica Epatite cronica Ematologica Insufficienza epatica con o senza encefalopatia, con o senza emolisi associata Renale Cirrosi Ipertensione portale e sue complicanze Oculare Neurologica Incoordinazione Disartria, salivazione eccessiva Facies amimica Scheletrica Tremore a riposo e intenzionale Paralisi pseudobulbare Sincope Miscellanea Emicrania Disautonomia Rigidità distonica Disfagia Deterioramento della scrittura: microscrittura Disturbi della personalità Disturbi del linguaggio Disturbi dell umore (depressione e psicosi) Riduzione delle prestazioni scolastiche Anemia emolitica Coombs-negativa Nefrolitiasi Tubulopatia Anello di Kayser-Fleischer Cataratta sunflower Perdita dell accomodazione Osteoporosi precoce Artropatia Pancreatite Ipoparatiroidismo Cardiomiopatia, disaritmie Cutaneo: lunulae ceruleae Oligomenorrea; infertilità; aborti ricorrenti 14

17 Malattia di Wilson: ancora una sfida diagnostica del talamo; sindrome distonica presente in pazienti con discinesia, disartria, e disturbi della personalità che correla con lesioni focali nel putamen e nel globo pallido. Nei pazienti pediatrici generalmente le manifestazioni neurologiche e/o psichiatriche precoci sono subdole: cambiamenti di personalità, alterazioni dell umore (depressione, psicosi), deterioramento del rendimento scolastico, incapacità di compiere attività che richiedono buona coordinazione mano-occhio ed alterazioni della scrittura come la micrografia. Le manifestazioni oculari della MW includono la presenza dell anello di Kayser-Fleischer (KF), dovuto alla deposizione di rame in corrispondenza della membrana di Descemet alla periferia della superficie posteriore della cornea. L anello di Kayser-Fleischer è frequentemente osservato in caso di esordio neurologico. La sua presenza anche se ritenuta suggestiva, non è completamente specifica della MW, poiché può esser presente anche in pazienti con epatopatia colestatica cronica. Inoltre nei bambini con MW ad esordio epatico, l anello di Kayser-Fleischer è generalmente assente (Nicastro et al., 2010). D altra parte, l assenza dell anello di Kayser-Fleischer non esclude la diagnosi di MW, anche in pazienti con malattia prevalentemente neurologica (Roberts et al., 2008). I pazienti con MW possono presentarsi con importanti manifestazioni extraepatiche diverse da quelle neurologiche o psichiatriche. Tra Tabella II. Score diagnostico per la malattia di Wilson (da Ferenci et al., 2003 modificato). Sistema a punti per la diagnosi della Malattia di Wilson Punti Sintomi Anelli di Kayser-Fleischer Presenti 2 Assenti 0 Coinvolgimento neurologico (o pattern tipico alla RMN dell encefalo) Severo 2 Moderato 1 Assente 0 Anemia emolitica Coombs-negativa Presente 1 Assente 0 Esami di laboratorio Cupruria (in assenza di epatite acuta) Normale (< 40 μg/24 h) 0 1-2xULN* 1 > 2xULN 2 Normale, ma > 5xULN dopo carico di penicillamina 2 Determinazione quantitativa del rame epatico (in assenza di colestasi) Normale (< 50 μg/g t.s.) -1 < 5xULN ( μg/g t.s.) 1 > 5xULN (> 250 μg/g t.s.) 2 Determinazione del rame epatico con rodanina Epatociti positivi alla rodanina presenti 1 Epatociti positivi alla rodanina assenti 0 Ceruloplasmina sierica Normale mg/dl 1 <10 mg/dl 2 Analisi mutazioni (mutazioni causanti la malattia) Mutazioni su entrambi i cromosomi 4 Mutazioni su un solo cromosoma 1 Nessuna mutazione trovata 0 INTERPRETAZIONE DELLO SCORE: 4 = affetto dalla MW 2-3 = MW probabile, sono richiesti ulteriori approfondimenti 0-1 = MW improbabile *ULN = Limite superiore della norma 15

18 G. Ranucci et al. queste ricordiamo le manifestazioni ematologiche che vanno dall anemia emolitica acuta Coombs-negativa all emolisi di basso grado che può associarsi con la MW quando l epatopatia non è clinicamente evidente. Altre manifestazioni comprendono alterazioni della funzione tubulare renale (aminoaciduria, proteinuria, uricosuria, ipercalciuria, iperfosfaturia, glicosuria, difettosa acidificazione urinaria, sindrome di Fanconi); alterazioni scheletriche (artrite, rachitismo, osteoporosi); alterazioni dermatologiche (iperpigmentazione della cute, acanthosis nigricans); disturbi endocrini (ipoparatiroidismo, infertilità, aborti spontanei ripetuti); cardiomiopatia; pancreatite. Aspetti diagnostici della MW La diagnosi precoce della MW è di fondamentale importanza ai fini della prognosi. Infatti, il trattamento, se iniziato precocemente, impedisce l insorgenza di lesioni gravi ed irreversibili legate all accumulo di rame. Una corretta diagnosi è impegnativa in età pediatrica, considerato che i criteri convenzionali validi per l età adulta non sempre sono applicabili ai bambini (Nicastro et al., 2010; Iorio et al., 2000). L eterogeneità dell espressività clinica e laboratoristica della MW spiega perché per formulare la diagnosi di MW in età pediatrica sia importante mantenere alto l indice di sospetto. Infatti non esistono singoli elementi clinici e/o laboratoristici che consentono una diagnosi certa di MW. Nel 2003 è stato proposto uno score diagnostico per la MW, che include criteri clinici, biochimici, istologici e molecolari (Ferenci et al., 2003). In tabella II è illustrato lo scoring system con il corrispondente cut-off diagnostico per ogni criterio validato nella popolazione pediatrica. Il suo punteggio totale indica la possibilità che il paziente sia affetto dalla MW: la diagnosi è altamente probabile quando lo score è maggiore o uguale a 4, probabile quando compreso tra 2 e 3, improbabile quando inferiore a 2. Questo score è stato validato nella popolazione pediatrica (Dhawan et al., 2005; Nicastro et al., 2010). In tabella III sono illustrati i test diagnostici utilizzati per la MW con i valori ritenuti orientativi per la diagnosi ed i principali motivi di falsa positività e negatività. Un test di primo livello è rappresentato dal dosaggio della ceruloplasmina sierica. Essa è ridotta nei pazienti con MW a causa dell alterata biosintesi e della breve emivita dell apoceruloplasmina (De Bie et al., 2005). Sono considerati diagnostici di MW valori di ceruloplasmina inferiori a 20 mg/dl (Ala et al., 2007). Poiché la ceruloplasmina è una proteina della fase acuta, essa si eleva in situazioni flogistiche epatiche e non; per cui nei casi di MW con epatite cronica istologicamente attiva, la ceruloplasmina può essere inizialmente nel range della norma. In tali casi la ceruloplasminemia può scendere sotto i 20 mg/dl solo dopo l opportuno trattamento farmacologico della MW. Inoltre è ben noto che esiste un sottogruppo di pazienti con MW (fino al 20%) che presenta valori di ceruloplasmina normali (Roberts et al., 2008; Iorio et al., 2004). Questo in parte può esser spiegato dalla presenza di mutazioni che non alterano la biosintesi della ceruloplasmina (Gromadzka et al., 2005). Al contrario, l ipoceruloplasminemia non sempre è indicativa di MW, potendosi riscontrare sia in pazienti eterozigoti per MW che in pazienti con altri disordini (Nicastro et al., 2009; Ala et al., 2007). In particolare, bassi livelli di ceruloplasmina sono stati osservati in pazienti con insufficienza epatica di diversa origine, nella malattia di Menkes, nella malnutrizione, nella sindrome nefrosica, nell enteropatia protido-disperdente, nell apoceruloplasminemia ereditaria (Hellman et al., 2002). Recentemente è stato riportato che anche pazienti con il deficit congenito della glicosilazione (CDG) possono presentare bassi livelli sierici di ceruloplasmina (Nicastro et al., 2009; Calvo et al., 2008; Mandato et al., 2006). Mak et al. hanno proposto come cut-off diagnostico per la ceruloplasmina quello di 14 mg/dl (Mak et al., 2008). Tuttavia è stato recentemente documentato che in età pediatrica la migliore soglia diagnostica della ceruloplasmina resta quella di 20 mg/dl (Nicastro et al., 2010). La cupruria basale delle 24 ore è un altro parametro utile per la diagnosi di MW. È importante che la raccolta delle 24 ore venga effettuata in maniera accurata, in un contenitore di plastica non contaminato e con l aggiunta di 2-3 ml di acido cloridrico al 5%. Il rame urinario riflette la quota del rame libero (non legato alla ceruloplasmina) circolante nel siero. Secondo Brewer, nei pazienti adulti sintomatici la cupruria delle 24 ore è sistematicamente superiore a 100 µg/die, valore considerato il limite convenzionale diagnostico (Brewer et al., 1992). Comunque, è da notare che in molte casistiche pediatriche una percentuale variabile dei bambini presenta livelli di Tabella III. Criteri diagnostici per la diagnosi di Malattia di Wilson in età pediatrica (da O Connor and Sokol, 2007, modificato) Test diagnostico Valori diagnostici Cause di falsa positività Cause di falsa negatività Ceruloplasmina sierica < 20 mg/dl Deficit congenito della glicosilazione, epatite fulminante, deficit nutrizionale di rame, protidodispersione, ipoceruloplasminemia ereditaria, eterozigote per la MW, malattia di Menkes Rame epatico > 250 μg/g tessuto secco Epatopatie croniche colestatiche, deficit congenito della glicosilazione, tumori epatici, sindrome nefrosica Cupruria basale delle 24 h > 40 μg/24 h Terapia con chelante del rame, epatite cronica attiva, epatopatie colestatiche croniche, insufficienza epatica, epatite autoimmune, inadeguato campionamento delle urine Cupruria dopo carico di penicillamina delle 24 h Presenza dell anello di Kayser- Fleischer > 1600 μg/24 h Epatopatia cronica colestatica, iperplasia nodulare rigenerativa, epatite autoimmune, inadeguato campionamento delle urine Epatite acuta (infiammazione), terapia estrogenica, gravidanza Errore di campionamento Pazienti con MW presintomatici, inadeguato campionamento Pazienti con MW presintomatici, inadeguato campionamento Presente Epatopatia cronica colestatica MW in stadio precoce 16

19 Malattia di Wilson: ancora una sfida diagnostica cupruria inferiori a tale cut-off (Muller et al., 2007; Nicastro et al., 2010). Nei bambini con MW, la cupruria basale sembra essere direttamente correlata con l età alla diagnosi, suggerendo un accumulo progressivo del metallo con il tempo (Nicastro et al., 2009). In accordo con tale dato, è stato recentemente dimostrato che la diagnosi di MW in età pediatrica deve esser presa in considerazione quando i livelli di cupruria sono maggiori di 40 mg/24h. Questa è la soglia ottimale sia per il test singolo che per il test utilizzato nel contesto dello scoring system (Nicastro et al., 2010, Roberts et al., 2008). La determinazione della cupruria delle 24 ore dopo carico di penicillamina, somministrata alla dose di 500 mg due volte al dì (all inizio della raccolta e dopo 12 ore), è stata suggerita nei soggetti con livelli di cupruria basale inferiori a 100 mg/24h (Roberts et al., 2008). Livelli superiori a 1600 µg/die sono ritenuti orientativi di MW (Roberts et al., 2008). Tuttavia una recente rivalutazione del test da carico di penicillamina in età pediatrica ha documentato con forte evidenza che il test non andrebbe praticato in bambini senza un epatopatia sintomatica, considerato che solo pazienti con un danno epatico severo legato alla MW hanno un test da carico positivo (Nicastro et al., 2010). Nell ambito dello scoring system di Ferenci si considerano diagnostici di MW livelli di cupruria dopo carico superiori a cinque volte il limite superiore della norma della cupruria basale. Tale limite è fissato da alcuni a 100 mg/24 h da altri a 40 mg/24 h (Ferenci, 2003). È stato recentemente dimostrato che riducendo il cut-off diagnostico della cupruria dopo carico di penicillamina a valori di 500 o 200 mg/24h, rispetto al valore classico di 1600 mg/24h, l accuratezza del test non migliora (Nicastro et al., 2010). La determinazione quantitativa del rame epatico rimane il gold standard per la diagnosi di MW. Il frustolo epatico per la determinazione del rame deve essere conservato in provetta senza additivi (per evitare la contaminazione con rame esogeno). Una concentrazione di rame a livello epatico superiore a 250 µg/g di peso secco (v. n. <50 µg/g di p.s.) è altamente indicativa di MW e livelli inferiori a 50 mg/g di peso secco escludono la diagnosi di MW. Tuttavia questo cut-off è stato molto criticato poiché considerato troppo alto e rappresentativo solo di pochi casi (Merle et al., 2007, Ferenci et al., 2005). Ferenci et al. (Ferenci et al., 2005) hanno proposto come cut-off più accurato il valore di 75 µg/g. di t.s, validato in una casistica di 149 pazienti con MW. Tuttavia il problema principale dell applicazione di un cut-off inferiore a quello accettato di 250 µg di p.s, è legato al fatto che gli eterozigoti possono collocarsi nella zona compresa tra 50 e 250 µg di p.s. La valutazione qualitativa del rame epatico, effettuata con le colorazioni per il rame o per le proteine associate al rame (orceina, rodanina, acido rubeanico) è di relativa utilità perché la negatività di tali test non consente di escludere la diagnosi di MW. Il ruolo della genetica Lo studio delle basi molecolari della MW attraverso la ricerca di mutazioni nel gene ATP7B in varie popolazioni nel mondo ha evidenziato la presenza di circa 520 variazioni di sequenza ( Esiste un alta eterogeneità allelica nella MW con la presenza di poche mutazioni relativamente frequenti e molte mutazioni rare. Come conseguenza nella maggioranza dei pazienti è presente lo stato di eterozigote composto per 2 mutazioni specifiche piuttosto che lo stato omozigote per una determinata mutazione. Esiste una certa prevalenza etnica in quanto in linea di massima si identificano mutazioni specifiche prevalenti nelle diverse popolazioni. La mutazione più frequente nel mondo è la p.h1069q con una frequenza allelica che varia Figura 3. Frequenza allelica della p.h1069q nel mondo. dal 17% nella popolazione italiana al 70% circa nella popolazione polacca (Ferenci et al., 2006; Fig. 3). La p.h1069q è assente nelle popolazioni dell estremo oriente dove prevale una mutazione relativamente frequente, la p.r778l, con una frequenza allelica che varia dal 16% circa nei giapponesi al 37% circa nella popolazione coreana e cinese (Ferenci et al., 2006; Li et al., 2011). Le strategie per lo studio genetico di una determinata malattia si basano principalmente su alcuni presupposti che riguardano la presenza di una correlazione genotipo-fenotipo, l epidemiologia delle mutazioni in una determinata popolazione e la localizzazione delle mutazioni all interno del gene in studio. Per quanto riguarda lo studio della correlazione genotipo-fenotipo nella MW, tale studio è molto limitato a causa dell alta eterogeneità allelica e la presenza di molte mutazioni rare. Conseguentemente non esistono dati statisticamente significativi di pazienti omozigoti per una mutazione specifica ed eterozigoti composti per le stesse mutazioni. Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi studi che analizzavano la correlazione genotipo-fenotipo in pazienti portatori della mutazione p.h1069q. Alcuni degli studi documentano che pazienti omozigoti per la H1069Q presentano un insorgenza più tardiva della malattia, con sintomi prevalentemente neurologici, con epatopatia più lieve, e con maggior frequenza del KF rispetto a pazienti eterozigoti composti che presentano quindi la H1069Q solo su un cromosoma o a pazienti con mutazioni diverse (Caca et al., 2001; Stapelbroek et al., 2004). Secondo altri studi invece non ci sono differenze nel fenotipo tra i 3 gruppi (Ferenci P et al., 2007; Merle U et al., 2010). Questi suggeriscono che oltre alle mutazioni nel gene ATP7B esistono altri fattori genetici o ambientali che possono contribuire nella variabilità fenotipica presente nella MW. La conoscenza dell epidemiologia delle mutazioni nei vari paesi e talvolta nelle varie regioni all interno dello stesso paese è molto importante in quanto permette di sviluppare strategie specifiche per lo studio genetico che in questo modo fornisce un grande contributo alla diagnosi di MW. Questo aspetto è stato ben studiato nella popolazione italiana. Negli ultimi anni è stato portato avanti uno studio sistematico per delineare la basi molecolari della MW nella popolazione italiana da parte del laboratorio di Epatopatie Genetiche dell Ospedale Microcitemico di Cagliari (Loudianos et al., 1998; Loudianos et al., 1999; Lepori et al., 2006; Zappu et al., 2008). Sono state analizzate 437 famiglie con la presenza di almeno un paziente affetto da MW, 185 delle quali 17

20 G. Ranucci et al. Tabella IV. Le mutazioni più frequenti identificate nella popolazione italiana* Mutazione N Cr. Esone Dominio % p.h1069q SEHPL 14.8 c.2532dela Tm4 4.9 p.r1319x Tm8 4.2 p. G591D 24 5 Cu5 4.2 p.r969q Tm6 3.8 c insc 20 8 Tm4 3.5 p.g626a 11 6 Cu6 1.9 c del Tm6 1.9 c.-441/-427del 11 Promoter Promoter 1.9 p.t977m Tm5 1.9 *Sono esclusi i pazienti Sardi, vedi tabella VI. Tabella V. Mutazioni identificate in 25 famiglie di origine pugliese Puglia Mutazione N Cr. Esone Dominio % p.g591d 19 5 Cu5 38 p.h1069q SEHPL 20 p.s1310r 4 19 ATPloop 8 c insc 3 8 Tm4 6 p.t977m 3 13 Ch/Tm6 6 p.i306t 2 2 Cu3 4 c a>g 2 7 Tm2 4 p.710s 1 8 Tm2 2 p.r969d 1 13 Ch/Tm6 2 p.a1003t 1 13 Ch/Tm6 2 p.q1095p 1 15 ATPloop 2 p.t1288m 1 18 ATPloop 2 Tabella VI. Mutazioni identificate in 152 famiglie di origine sarda Sardegna Mutazione N Cr. Esone Dominio % -441/-427del UTR Promoter 64.9 p.v1146m ATPloop 7.94 c.2463delc Td 7.28 c delat 7 2 Cu p.a1018v 6 13 ATPloop 1.98 p.r778w 6 8 Tm c inst 4 3 Cu p.g1000r 4 13 Ch/Tm p.h1069q 4 14 SEHPL 1.32 c insc 3 8 Tm c.2035delc 2 7 Tm1-Tm p.g869r 2 11 Td 0.66 p.s921q 2 12 Tm p.t993m 2 13 Ch/Tm c g->t 1 2VI Cu c T->G 1 8 Tm p.i747f 1 8 Tm p.v890m 1 11 A-domain 0.33 p.r919w 1 12 Tm p.g943s 1 12 Tm p.l1043p 1 14 ATPloop 0.33 p.g1089v 1 15 ATPloop 0.33 p.r1151c 1 16 ATPloop 0.33 p.n1270s 1 18 ATPhinge 0.33 c del ATPhinge 0.33 Unknown di origine sarda. Lo studio molecolare ha permesso l identificazione di 124 mutazioni appartenenti a tutte le categorie, missenso, nonsenso, delezioni, inserzioni e sito di splicing. Se consideriamo la sola popolazione italiana con l esclusione di quella sarda, nelle 285 famiglie analizzate sono state identificate 115 mutazioni, dato che suggerisce la presenza di un alta eterogeneità allelica. Non esistono mutazioni frequenti nell intera popolazione in quanto la somma delle dieci mutazioni più frequenti costituisce appena il 43% del totale (Tab. IV). Esiste una certa distribuzione regionale in quanto certe mutazioni prevalgono e caratterizzano determinate aree geografiche. Gli esempi più tipici sono costituiti dalle popolazioni pugliese e sarda. Nella popolazione pugliese lo studio delle mutazioni in 25 famiglie ha evidenziato la presenza di 5 mutazioni più frequenti che costituiscono l 80% degli alleli (Tab. V). Di queste la più frequente, la p.g591d, è presente nel 38% degli alleli. In Sardegna lo studio delle basi molecolari della MW ha evidenziato la presenza di 25 diverse mutazioni (Tab. VI). La mutazione più comune -441_427del costituisce circa il 65% degli alleli. Le 6 mutazioni più comuni costituiscono circa l 85% del totale. Questi dati suggeriscono una certa omogeneità allelica e permettono una strategia efficace per lo studio genetico. In particolare nella popolazione sarda, dove l incidenza della MW è di 1:3000 nati vivi, quindi una delle più alte nel mondo, lo studio genetico potrebbe essere utilizzato con efficacia non solo nella diagnosi di singoli casi ma anche in uno screening di massa per la diagnosi ed il trattamento precoce della malattia (Zappu et al., 2008). La localizzazione delle mutazioni all interno del gene ATP7B è un altro aspetto importante ai fini dello studio genetico. Lo studio genetico di circa 700 famiglie di origine mediterranea ha evidenziato che l 80% delle mutazioni identificate risiedono in 12 esoni (5, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), considerati hotspot, dei 21 esoni del gene (Lepori et al., 2006). Esiste quindi una clusterizzazione delle mutazioni nel gene ATP7B indipendentemente dall origine etnogeografica dei pazienti. Tale dato è molto importante in quanto rende efficiente il test genetico indicando lo studio delle regioni hotspot come primo bersaglio. Lo studio genetico negli ultimi anni ha dato un grande contributo e ormai è parte integrante dell iter diagnostico della MW. La sua efficienza e utilità nella diagnosi della malattia dipende non solo dallo sviluppo di nuove tecniche raffinate ma anche dalla appropriatezza nella sua richiesta. Infatti, come in qualsiasi malattia genetica, an- 18