Differenti tipi di PCR

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1 Differenti tipi di PCR Colony PCR Nested PCR Multiplex PCR AFLP PCR Hot start PCR In situ PCR Inverse PCR Asymmetric PCR Long PCR Long accurate PCR Reverse transcriptase PCR Allele Specific PCR Real time PCR

2 Colony PCR

3 Nested PCR E un metodo molto sensibile per analizzare agenti patogeni e parassiti

4 Multiplex PCR

5 Amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR PCR: using primers containing RE sites E un metodo altamente sensibile per analizzare polimorfismi nel DNA

6 In situ PCR on fixed tissue or cells E un metodo molto sensibile per la diagnosi di virus ed agenti infettivi, caratterizzazione di cellule cancerogene, mutazioni genetiche ereditarie, studi di espressione di geni specifici

7 In situ PCR on fixed tissue or cells

8 Reverse PCR RE 1 RE 2

9 Asymmetric PCR Si basa sull amplificazione preferenziale di un filamento per inserire mutazioni geniche

10 Long PCR Standard choice for long template with improved fidelity PCR Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Choice for long template with high specificity & fidelity AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity Ultimate choice for extra-long template Elongase Enzyme Mix Learn more > Most popular Amplicon size 20 kb 20 kb Up to 30 kb Fidelity 6x 9x 5x Activation time 30 seconds 15 seconds 30 seconds

11 Allele specific PCR Usata per il clonaggio o la diagnosi di SNPs La sequenza deve essere nota e uno dei due primers deve essere posizionato sullo SNP Le condizioni di reazione devono essere stringenti per avere il riconoscimento specifico del primer

12 Applications of PCR Molecular identification Molecular Archaeology Molecular Epidemiology Molecular Ecology DNA fingerprinting Classification of organisms Genotyping Pre-natal diagnosis Mutation screening Drug discovery Genetic matching Detection of phatogens Sequencing Bioinformatics Genomic cloning Human Genome Project Genetic Engineering Site-directed mutagenesis Gene expression studies

13 DNA profiling (test di paternità e diagnostica forense per scopi medico-legali) estrazione del DNA da campioni biologici genotipizzazione di 16 regioni del DNA altamente polimorfiche in lunghezza, variabili da individuo ad individuo, conosciute come regioni microsatelliti profilo del DNA (DNA profiling o impronta genetica) grazie al quale identificare un individuo.

14 Elettroforesi Capillare o su gel con gradiente di temperatura (TGGE) per analisi di SNP nel DNA usando prodotti PCR CE 2 alleli normale omozigote = homoduplexes 1 allele polimorfico eterozigosi = heteroduplexes

15 La DNA ligasi catalizza il legame di un'estremità di un frammento di DNA al 5' col 3 di un frammento di DNA. Questo meccanismo può essere utilizzato per indagare la presenza di un SNP usando due sonde da ibridare direttamente sul sito polimorfico dello SNP, per cui il legame può verificarsi se le sonde sono identiche al DNA bersaglio. Nel saggio le due sonde sono progettate in modo tale che una sonda è allele-specifica e ibridizza al DNA bersaglio in modo che l ultima base della sua estremità 3 si trovi direttamente sopra il nucleotide SNP e una seconda sonda si ibrida a valle del sito polimorfico SNP fornendo un estremità 5' per la reazione di ligasi. La reazione si verifica solo quando l oligonucleotide allele-specifico risulta perfettamente ibridato Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)

16 Spot of DNA fragments synthetic oligonucleotides 2x10 6 SNP SNP arrays

17 SNPs array in Genome-wide association study (GWAS)

18 Clustering SNP array

19 Gli SNPs: associati allo sviluppo di patologie, alla risposta ad agenti patogeni, chimici, ai farmaci si distingue dalla farmacogenetica in sullo studio dei polimorfismi genetici. IMPORTANZA: sviluppo di nuovi farmaci e nella diagnostica, in quanto consentono di conoscere l'effetto di un farmaco su un individuo ancor prima della somministrazione queste sono le basi della farmacogenomica e dal momento che gli SNPs sono, inoltre, ereditati di generazione in generazione essi vengono utilizzati anche in farmacogenetica (DEFINIZIONI: la farmacogenetica viene definita come "LO STUDIO DELLE VARIAZIONI INTER-INDIVIDUALI NELLA SEQUENZA DEL DNA IN RELAZIONE ALLA RISPOSTA AI FARMACI", mentre alla farmacogenomica viene riservato un significato più ampio, applicabile alla scoperta e al disegno di nuovi farmaci e al loro sviluppo clinico.)