Dipartmento di Genetica e Biologia dei microrganismi

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PARMA Dipartmento di Genetica e Biologia dei microrganismi Sezione di Microbiologi degli alimenti

2 latte formaggio modificazioni biochimiche associate all attività metabolica di microrganismi

3 QUALITÀ MICROBIOLOGICA (modificazioni: biochimiche e reologiche) Microrganismi motore del processo

4 Ruolo dei microrganismi nei prodotti lattiero caseari Salubrità ed esito tecnologico Gestione fermentazione SICUREZZA E QUALITA RAPPORTO TRA TECNOLOGIA E BATTERI

5 Microrganismi: Latte crudo Innesto Cellule microbiche intere Enzimi liberi (prime ore stagionatura) Maturazione: è un processo enzimatico Glicolisi Proteolisi Lipolisi RICONOSCIBILITÀ E DIVERSITÀ

6 Caseine Attività secondaria del caglio?? Plasmina Catepsine??? LAB Endopeptidasi LAB Esopeptidasi Oligopeptidi e aminoacidi liberi caseins peptons peptides oligopeptides aminoacids Mw

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8 PRIME ESPERIENZE NELL IMPIEGO DI INNESTI L adozione dell utilizzo del sieroinnesto per la produzione di formaggio Grana risale alla fine del secolo scorso. Gli studi di Gorini e Spallanzani avevano enfatizzato l importanza dei microrganismi nel processo di caseificazione e Notari, prima, e poi Fascetti individuavano l innesto come possibile metodo per contenere i difetti di gonfiore.

9 starter acidificazione rapida

10 Cagliata di 24 ore

11 Forma di 1 mese

12 Evoluzione microflora Grana ore ore 2-5 mesi Oltre 5 mesi 24 mesi Lattobacilli termofili omofermentanti innesto naturale Lattobacilli termofili omo ed eterofermentanti innesto naturale, lieviti Maggioritari lattobacilli termofili omofermentanti, lattobacilli mesofili lattobacilli mesofili, pediococchi,, lieviti Poche cellule di pediococchi o lieviti

13 Sviluppo microflora in differenti zone del formaggio Microflora totale L.helveticus L.delbrueckii lactis Diminuzione in cottura ufc/gr Diminuzione in cottura ufc/gr Non rinvenibile prime fasi Prevalenza zona esterna dalle 24h ai 4 mesi, poi riequilibrio 10 6 ufc/gr Discesa lenta fino a fine stagionatura Prevalenza zona esterna 80 h poi rapida diminuzione Comparsa dopo le h e prevalenza nelle zone centrali Discesa lenta fino a fine stagionatura

14 Modalità preparazione sieroinnesto Definizione composizione microbiologica selezione della microflora in base alle condizioni imposte dal singolo processo caseario (specifica)

15 Innesto naturale Principali vantaggi: semplicità d uso e bassi costi tradizione complessità e variabilità microbiologica resistenza all attacco fagico Principali inconvenienti: composizione complessa e non ancora completamente compresa fluttuazione performances tecnologiche

16 Fenotipi utili per studio attività sieroinnesto naturale Acidificazione Resistenza fago Crescita a temperature non ottimali Produzione di batteriocine Interazioni con altri ceppi Produzione composti aromatici

17 Crescita microbica in condizioni di stress per i microrganismi Temperature ph Aw Substrato composizione ( zucchero, proteine, peptidi, etc) Siero cagliata formaggio ( tempi stagionatura)

18 Tecnologia di produzione del Parmigiano Reggiano formatura: acidificazione e spurgo del siero Raccolta latte crudo sieroinnesto 2,5-3% caglio incubazione h Siero dolce caldo Scrematura per affioramento Coagulazione (10-12 min) Taglio e rottura della cagliata Cottura della cagliata C e sosta sotto siero Panna salatura salamoia satura per giorn stagionatura C; 80-85% UR 9-12 mesi

19 Evoluzione microflora nel formaggio Modificazioni del prodotto associate a produzione e stagionatura Quando arriva il mio momento..? Regolata: Selezione biotipi adatti Parametri Tecnologici (T C) Presenza altri microrganismi (interazioni positive o inibitorie) Modificazioni del substrato indotte dalla tecnologia e/o attività microbica(aw, ph, NaCl, etc.)

20 batteri lattici Tassonomia (classificazione, nomenclatura e identificazione) in base a morfologia, attività metabolica, condizioni di crescita e, più recentemente, omologia di sequenza di zone del DNA (+/- conservate) Differenti Generi Specie Biotipi Classificazione è in continua e veloce evoluzione

21 ATTIVITA METABOLICA DEI BATTERI LATTICI Regolata: Parametri Tecnologici (T C, tempi) Presenza altri microrganismi (interazioni positive o inibitorie) Modificazioni del substrato indotte dalla tecnologia e/o attività microbica(aw, ph, NaCl, etc.)

22 Altri substrati differenti dal latte Siero di latte ( frazioni azotate, potere tampone, etc.) Cagliata ( frazioni azotate, Aw, disponibilità zucchero, potere tampone, etc.) Formaggio ( frazioni azotate, Aw, disponibilità zucchero, etc)

23 Presenza e sviluppo batteri lattici nei derivati del latte fermentati ph NaCl temperatura forme azotate batteriocine % zucchero Metaboliti primari Selezione microrganismi che meglio si adattano alle condizioni del substrato che si modifica

24 Modificazioni del prodotto associate a produzione e stagionatura Selezione specie e biotipi adatti in uno specifica fase stagionatura Parametri di processo

25 BIODIVERSITA Osservata in tutte le specie lattiche Genotipo (zone conservate e variabili del DNA) Espressione fenotipica

26 Biodiversità e fenotipi di rilievo tecnologico Capacità di utilizzare differenti zuccheri Capacità acidificante (resistenza ph e velocità acidificazione) Resistenza al NaCl Temperatura ottimale di crescita e capacità metabolizzare a temperature non ottimali Attitudine alla proteolisi Esigenze nutrizionali Produzione sostanze aromatiche Resistenza/sensibilità infezione fagica Produzione batteriocine Produzione sostanze addensanti Capacità di adesione a differenti superfici

27 Biodiversità e sopravvivenza La biodiversità si traduce in differente possibilità di sopravvivere in un substrato Quindi Differente attitudine alla trasformazione tecnologica

28 Ma quale è il vero ruolo del sieroinnesto naturale??? Solo acidificazione e inibizione patogeni ed alterativi? Specifico legame con tecnologia di produzione? Portatore di tipicità e di legame con il territorio?. a cosa servo?.. Quando arriva il mio momento..? MOLTE INCERTEZZE E DIBATTITI IN MERITO

29 Sieroinnesto e qualità FUNZIONALITA TECNOLOGICA Starter FUNZIONALI??????????????? AUTOCTONI

30 Microflora e DOP Microrganismi come possibile legame tra prodotto e territorio microflora autoctona

31 il sieroinnesto naturale Dopo le prime esperienze condotte da Gorini e collaboratori, verso la metà del secolo furono principalmente Renko e Parisi a dedicarsi agli studi sulla microbiologia del sieroinnesto ed ad indicare come la maturazione del Grana fosse principalmente da attribuire ai bastoncini (Thermobacterium) in esso contenuti. Gli studi di Politi, Carbone ed altri autorevoli ricercatori evidenziarono nei sieroinnesti la presenza variabile sia di forme cocciche che di bastoncini; Carbone nel 1958 (15) riassumendo concludeva che..il siero-fermento per Grana presenta in genere una carica microbica superiore al mezzo miliardo di microbi per cc, costituita in netta maggioranza da forme a bastoncino.

32 La storia ci insegna la continua evoluzione negli anni della composizione della microflora degli innesti in relazione sia alla modificazione degli ecosistemi ambientali che, e soprattutto, alle variazioni della tecnologia di produzione è stata osservata nel tempo. Prima Renko negli anni 40 e poi Bottazzi riprendendone gli studi hanno evidenziato come dagli inizi del secolo in poi la microflora del sieroinnesto sia mutata da una miscela di microrganismi sostanzialmente mesofili ad una di microrganismi termofili. Questa modificazione è probabilmente da mettere sia in relazione alle diverse temperature di cottura della cagliata sia alle condizioni di incubazione del siero dolce. Allo stato attuale la ricerca ha confermato queste osservazioni ed il legame tra microflora naturale e tecnologia è un dato di fatto.

33 Modificazione delle specie presenti Scomparsa di specie un tempo ritenute caratteristiche L.delbrueckii subsp.bulgaricus L.helveticus-yugurti????? Presenza di specie minori S.thermophilus?????? Modificazione biotipi (L.helveticus) Effetto modificazione tecnologie di produzione?????

34 Innesto naturale Presenza di ceppi utili al metabolismo nel sieroinnesto Presenza di ceppi utili al metabolismo in cagliata Presenza di ceppi non necessari

35 Presenza di biotipi a differente adattabilità al substrato ceppi siero - cagliata

36 Presenza di biotipi che si adattano ai gradienti di temperatura Zona esterna Zona intermedia Zona cuore Temperature, C Time, h

37 Studio biodiversità in batteri lattici isolati da diverse Aree geografica Nicchie di produzione Periodi storici di isolamento

38 Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano e Grana Padano L helveticus pianura S 18 P.Reggiano L helveticus pianura S 10 P.Reggiano L helveticus ATCC L helveticus ft 5 Grana L helveticus 3 s Grana L helveticus pianura Q 5 P.Reggiano L helveticus pianura Q 8 P.Reggiano L helveticus pianura S 14 P.Reggiano L helveticus hbt 4 Grana L helveticus ft 8 Grana L helveticus ft 6 Grana L helveticus pianura R 7 P.Reggiano L helveticus pianura R 10 P.Reggiano L helveticus montagna O 4 P.Reggiano L helveticus montagna M 5 P.Reggiano L helveticus montagna N 14 P.Reggiano L helveticus pianura Q 7 P.Reggiano L helveticus montagna M 11 P.Reggiano L helveticus montagna M 4 P.Reggiano L helveticus Lh25 Grana L helveticus Lh26 Grana L helveticus Lh23 Grana L helveticus Lh30 Grana L helveticus Lh32 Grana L helveticus Lh31 Grana L helveticus Lh22 Grana L helveticus Lh24 Grana L helveticus Lh29 Grana L helveticus Lh4 Grana L helveticus Lh27 Grana L helveticus Lh21 Grana L helveticus TH456 Grana L helveticus montagna N 1 P.Reggiano L helveticus Lh28 Grana L helveticus Lh8 Grana L helveticus Lh15 Grana L helveticus Lh16 Grana L helveticus Lh1 Grana L helveticus Lh9 Grana L helveticus Lh12 Grana L helveticus Lh13 Grana L helveticus Lh10 Grana L helveticus Lh17 Grana L helveticus Lh18 Grana L helveticus Lh19 Grana L helveticus Lh20 Grana L helveticus Lh2 Grana L helveticus Lh3 Grana L helveticus Lh14 Grana L helveticus Lh11 Grana L helveticus Lh5 Grana L helveticus Lh6 Grana L helveticus Lh7 Grana L helveticus 14s Grana L helveticus 14d48 Grana L helveticus 15b Grana L helveticus 3a48 Grana L helveticus 1 s Grana L helveticus 15b48 Grana L helveticus 37s Grana L helveticus sf 1 Parm.Regg. L helveticus sf 2 Parm. Regg. L helveticus pianura S 8 P.Reggiano PR GP

39 Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano Lact helveticus S13 pianura Lact helveticus R 1 pianura Lact helveticus S 2 pianura Lact helveticus S 4 pianura Lact helveticus R 5 pianura Lact helveticus M 5 montagna Lact helveticus S11 pianura Lact helveticus R13 pianura Lact helveticus S 7 pianura Lact helveticus M 7 montagna Lact helveticus Q11 pianura Lact helveticus N 1 montagna Lact helveticus S19 pianura Lact helveticus M 12 montagna Lact helveticus N 9 montagna Lact helveticus N10 montagna Lact helveticus M 3 montagna Lact helveticus N 5 montagna Lact helveticus N13 montagna Lact helveticus N 8 montagna Lact helveticus N 3 montagna Lact helveticus N 6 montagna Lact helveticus N15 montagna Lact helveticus M 2 montagna Lact helveticus N16 montagna Lact helveticus 0 4 montagna Lact helveticus 011 montagna Lact helveticus 0 7 montagna Lact helveticus 0 8 montagna Lact helveticus M 15 montagna Lact helveticus 014 montagna Lact helveticus M 8 montagna Lact helveticus M10 montagna Lact helveticus M 9 montagna Lact helveticus 019 montagna Lact helveticus Q 4 pianura Lact helveticus 0 20 montagna Lact helveticus 017 montagna Lact helveticus 018 montagna Lact helveticus Q 2 pianura Lact helveticus Q12 pianura Lact helveticus 0 9 montagna Lact helveticus M11 montagna Lact helveticus M 1 montagna Lact helveticus M 6 montagna Lact helveticus S 9 pianura Lact helveticus S12 pianura Lact helveticus S10 pinaura Lact helveticus N14 montagna Lact helveticus Q 1 pianura Lact helveticus 010 montagna Lact helveticus Q 6 pianura Lact helveticus 016 montagna Lact helveticus M 4 montagna Lact helveticus 012 montagna Lact helveticus S16 pianura Lact helveticus Q 7 pianura Lact helveticus S 8 pianura Lact helveticus S14 pianura Lact helveticus R 6 pianura Lact helveticus R14 pianura Lact helveticus S17 pianura Lact helveticus Q 5 pianura Lact helveticus S18 pianura Lact helveticus Q 8 pianura Lact helveticus R 8 pianura Lact helveticus R 10 pianura Lact helveticus R 7 pianura pianura montagna pianura

40 COMPLESSITA SIEROINNESTO NATURALE Composizione in specie Interazioni tra ceppi differenti Interazione batteriofago ceppi Presenza di biotipi differenti Presenza di cellule batteriche non coltivabili