ATTIVITA CELLULARE. Segnale. Attivazione di specifici pacchetti di geni. Esecuzione di uno dei programmi di attività cellulare

Transcript

1 ATTIVITA CELLULARE Segnale Attivazione di specifici pacchetti di geni Esecuzione di uno dei programmi di attività cellulare Proliferazione Differenziamento Arresto e Quiescenza Morte cellulare

2

3 MORTE CELLULARE

4 NECROSI MECCANISMI DI MORTE CELLULARE Evento accidentale Passivamente subito dalle cellule Interessa gruppi di cellule Dovuto a trauma, veleno, anossia, ecc La lisi della cellula causa fenomeni di infiammazione e di autoimmunità APOPTOSI Evento programmato Attivamente realizzato dalle cellule Interessa cellule singole Realizzato di norma in condizioni fisiologiche La frammentazione della cellula e le modificazioni di superficie favoriscono la fagocitosi AUTOFAGIA - Permette alle cellule in condizione di malnutrimento o prive di fattori di crescita di sopravvivere. Se la mancanza di stimoli persiste le cellule si autodigeriscono e muoiono.

5 LA NECROSI La necrosi, è l evidenza strutturale della morte di gruppi di cellule di un tessuto o di un organo. Nella zona di avvenuta necrosi le delimitazioni extracellulari scompaiono ed il tessuto si trasforma in una massa amorfa, con conseguente rilascio di sostante intracellulari negli spazi extracellulari. Questo fenomeno comporta, spesso, attivazione di un processo infiammatorio in quanto le sostanze rilasciate dalla cellula necrotica possono richiamare (chemiotassi) i leucociti o attivare una risposta antigenica

6 Nabissi 2014

7 Necrosi Le modificazioni ultrastrutturali della cellula, in cui si è attivato il processo di morte per necrosi, possono essere suddivise come segue: - Cariolisi (degradazione del DNA causata dall attività delle DNasi) - Picnosi: (riduzione del nucleo) - Cariolessi: (frammentazione del nucleo picnotico, fino alla sua scomparsa) - Alterazioni della membrana plasmatica, deplezione di ATP e della struttura dei mitocondri, dilatazione del reticolo endoplasmatico (per aumento del Ca 2+ intracellulare, perdita dell osmolarità cellulare

8 Mediatori del processo di necrosi Specie reattive dell ossigeno, ioni calcio, PARP (poly ADP ribose polymerase) PARP è una DNA-repair enzyme che puo diminuire fortemente le riserve di ATP quando catalizza la riparazione del DNA, che avviene durante un danno.

9 Proteasi calcio-attivate non lisosomiali (Calpaine) e catepsine mediano il processo di necrosi. Calpaine si attivano quando la concentrazione di calcio è elevata. Le Catepsine vengono liberate nel citoplasma dopo che le calpaine attivate compromento l integrità delle membrane lisosomiali. I lisosomi contengono piu di 80 tipi diversi di enzimi idrolitici, incluso le catepsine. Rilasciati nel citoplasma questi enzimi degradano le strutture cellulari, interferendo con il normale metabolismo, e la morte è inevitabile.

10 CARATTERISTICHE NECROSI VOLUME CELLULARE AUMENTO NUCLEO PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI MEMBRANA CITOPLASMATICA DANNEGGIATA CONTENUTO CELLULARE DIGESTIONE ENZIMATICA INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI FREQUENTE RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO SEMPRE PATOLOGICO

11 Inoltre la cellula necrotica puo avere un aspetto piu trasparente rispetto alla cellula normale (perdita del contenuto di glicogeno). Un altro fenomeno presente nel processo necrotico consiste nella calcificazione delle cellule, con riempimento della cellula morta con fosfolipidi degradati (dette figure mieliniche), che vengono poi degradate dai macrofagi, con formazione di saponi di calcio ed di un sito infiammatorio.

12 STEATONECROSI CON SAPONIFICAZIONE. Saponi di calcio nelle zone di distruzione lipidica Figure mieliniche

13 La necrosi del tessuto puo essere classificata come: Necrosi coagulativa: denaturazione completa della cellula, tessuto duro e biancastro in cui le proteine possono andare incontro ad un processo di denaturazione. La necrosi coagulativa implica la conservazione della struttura della cellula per alcuni giorni, come nel caso dell infarto del miocardio dove il danno o l aumento di acidosi cellulare denatura le proteine ma anche gli enzimi degradativi. Un tipo particolare di necrosi coagulativa è la necrosi caseosa, che si incontra spesso nel granuloma tubercolare. Deve il suo nome all aspetto macroscopico del tessuto (bianco e simile al formaggio). Si distingue dalla normale necrosi coagulativa perché in essa la normale architettura del tessuto appare completamente scomparsa.

14 POLMONE TUBERCOLARE- NECROSI CASEOSA

15 La necrosi coagulativa implica la conservazione della struttura della cellula per alcuni giorni, come nel caso dell infarto del miocardio dove il danno o l aumento di acidosi cellulare denatura le proteine ma anche gli enzimi degradativi A) Miocardio normale, B) cellule del miocardio prive di nucleo

16 Necrosi colliquativa: predomina la digestione enzimatica, il tessuto diventa molle e liquefatto principalmente come conseguenza dell azione degli enzimi litici rilasciati dai leucociti, richiamati nel sito necrotico (chemiotassi). La necrosi colliquativa è caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi stimolano l accumulo di cellule infiammatorie. La completa digestione delle cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e viscosa, comprende spesso la formazione di pus.

17 Necrosi colliquativa Caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi stimolano l accumulo di cellule infiammatorie. Completa digestione delle cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e viscosa. Spesso conprende la formazione di pus.

18 Un altro tipo particolare di necrosi è la gangrena che si verifica in un arto con interruzione completa dell irrorazione sanguigna e conseguente necrosi coagulativa. Se si sovrappone un infezione batterica con conseguente colliquazione si definisce gangrena umida. Necrosi grassa (steatonecrosi): indica la presenza di zone di distruzione lipidica causate dal rilascio di lipasi

19 APOPTOSI: suicidio cellulare È una modalità di morte cellulare attiva, tipica delle cellule di organismi pluricellulari e viene anche descritta come una forma di suicidio altruista, in quanto spesso la cellula si sacrifica per il bene dell intero organismo. Le modalità della morte per apoptosi sono finalizzate a evitare l instaurarsi di fenomeni di INFIAMMAZIONE e di AUTOIMMUNITÀ, ed il fatto che non dia luogo a fenomeni di infiammazione fa sì che la morte cellulare non sia avvertita dall organismo (morte indolore)

20 PERCHÉ SI PARLA DI PROGRAMMA APOPTOTICO? Perché l apoptosi è un processo cellulare innescato da induttori specifici, in quanto richiede la trascrizione di specifici geni. L apoptosi fisiologica avviene naturalmente nell organismo, per favorire l eliminazione di cellule che hanno terminato la loro funzione, in cellule danneggiate o in condizioni d adattamento cellulare

21 SVILUPPO EMBRIONALE/FETALE E METAMORFOSI NORMALE TURN-OVER TISSUTALE: epitelio intestinale, i neutrofili dopo il termine dell infiammazione, linfociti al termine di una risposta immunitaria. ONTOGENESI E OMEOSTASI DEL SISTEMA IMMUNITARIO: L eliminazione di linfociti auto-reattivi potenzialmente pericolosi, prima e dopo la loro formazione e maturazione. ATROFIA ORMONE-DIPENDENTE: L involuzione ormone-dipendente nell adulto, come la distruzione delle cellule dell endometrio durante il ciclo mestruale, atresia dei follicoli ovarici nella menopausa, regressione della mammella dopo svezzamento, atrofia prostatica dopo castrazione. DEPRIVAZIONE DI FATTORI DI CRESCITA o INDUCENTI: L eliminazione cellulare in popolazioni cellulari proliferanti.

22 APOPTOSI TOSSINE, FARMACI RADIAZIONI INFEZIONI VIRALI CITOTOSSICITÀ CELLULO-MEDIATA: la morte cellulare indotta dai linfociti citotossici, un meccanismi di difesa contro linfociti infettati da virus o contro cellule tumorali. Per apoptosi patologica s intende la morte cellulare indotta da una serie di stimoli dannosi, ad esempio il danno cellulare in particolari malattie virali, come l epatite virale in cui l eliminazione delle cellule è largamente dipendente dall apoptosi, l atrofia patologica negli organi parenchimali dopo ostruzione dei dotti (pancreas, reni) e la morte cellulare nelle neoplasie.

23 Quindi l apoptosi si puo definire un programma intracellulare strettamente regolato, in cui le cellule destinate a morire attivano enzimi che degradano il DNA, le proteine nucleari e citoplasmatiche. La membrana citoplasmatica rimane intatta ma la struttura della cellula si altera a tal punto da essere bersaglio di cellule fagocitarie.

24 Infatti una delle differenze tra l apoptosi e la necrosi consiste appunto nell assenza, nell ambiente extracellulare circostante, di costituenti cellulari derivanti dalla cellula morta per apoptosi.

25 Nabissi 2014

26 CARATTERISTICHE NECROSI APOPTOSI VOLUME CELLULARE AUMENTO RIDOTTO NUCLEO MEMBRANA CITOPLASMATICA CONTENUTO CELLULARE PICNOSI-CARIOLESSI- CARIOLISI DANNEGGIATA DIGESTIONE ENZIMATICA FRAMMENTAZIONE INTATTA INTATTO, PUO ESSERE SECRETO IN CORPI APOPTOTICI INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO FREQUENTE SEMPRE PATOLOGICO NO SPESSO FISIOLOGICO, MEZZO PER ELIMINARE LE CELLULE

27 CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE DELL APOPTOSI Le cellule apoptotiche mostrano delle caratteristiche biochimiche che sono alla base delle modificazioni struttutali descritte. CLIVAGGIO DELLE PROTEINE La degradazione delle proteine coinvolge le CASPASI, proteasi cisteina-dipendenti, che sono presenti, come proenzimi, nella cellula in condizione fisiologica e devono essere attivati per indurre apoptosi. Le caspasi oltre che distruggere altre proteine attivano Dnasi che degradano il DNA. AUMENTO DELLA CONCENTRAZIONE DI Ca 2+ INTRACELLLULARE Le modificazioni biochimiche della membrana plasmatica inducono variazioni osmotiche ed della concentrazione elettrolitica nella cellula apoptotica. Tali variazioni inducono entrata di Ca 2+ dall ambiente extracellulare e rilascio di Ca 2+ dai depositi intracellulari (reticolo endoplasmatico liscio, mitocondri). L aumento di Ca 2+ è alla base dell attivazione di diversi enzimi con attività degradativi verso proteine e DNA.

28 ROTTURA DEL DNA Il DNA viene tagliato in multipli di bp da endonucleasi Mg 2+ e Ca 2+ dipendenti RICOGNIZIONE FAGOCITARIA Le cellule apoptotiche esprimono fosfatidilserina sulla parte esterna della membrana (evidenziabile colorando le cellule con annexina V). Queste modificazioni a livello di membrana possono essere riconosciute dai macrofagi che fagocitano così le cellule apoptotiche. A- DNA cellule integre B- DNA di cellule in apoptosi C- DNA di cellule in necrosi

29 Immagini di cellule in apoptosi

30 Apoptosis and Necrosis analysis Annexin + PI Facs Analysis

31 MECCANISMI di attivazione dell APOPTOSI L APOPTOSI E INDOTTA DA STIMOLI ESTERNI E/O INTERNI, IN GRADO DI ATTIVARE DUE VIE (PATHWAYS) IN PARTE DISTINTE CHE VENGONO IDENTIFICATI COME: PATHWAY INTRINSECO, controllato dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale PATHWAY ESTRINSECO, nel quale recettori di morte stimolano la cascata di eventi apoptotici. I mediatori di entrambi i pathways sono LE CASPASI, infatti il processo apoptotico consiste in una fase iniziatrice (durante la quale vengono attivate le caspasi iniziatrici) e in una fase effettrice in cui il secondo gruppo di caspasi (effettrici) agiscono per indurre la morte cellulare.

32 CASPASI C = cisteina nel centro reattivo; ASP = riconoscono un residuo di acido aspartico nell ambito di una sequenza di 4 aminoacidi; ASI = sono enzimi proteolitici Le caspasi sono presenti nel citoplasma in forma di zimogeni e vengono attivate successivamente all attivazione dei pathways apoptotici. Le caspasi iniziatrici (2, 8, 9, 10) sono attivate dagli adattatori ; a loro volta attivano le caspasi effettrici (3, 6, 7). (La caspasi 1, 4, 5 sono coinvolte nella maturazione di citochine). L attivazione consiste nel taglio proteolitico, con formazione di due frammenti; i 2 frammenti brevi e i 2 frammenti lunghi di due caspasi uguali formano un tetramero (forma attiva).

33

34 SUBSTRATI DELLE CASPASI EFFETTRICI

35 Substrati sensibili CAD (deossiribonucleasi caspasi-sensibile): presente nel citosol in forma inattiva e mediante distacco dell inibitore causato dalla caspasi 3, la CAD migra nel nucleo degradando i nucleosomi, frammentando il DNA in frammenti di circa 180 bp.

36 PARP-1 (poli-adp-ribosio polimerasi) che inattivata dalla caspasi 3, non puo piu svolgere la funzione di enzima responsabile della riparazione del DNA e d inibitore delle endonucleasi.

37 Casp-3 e degradazione delle proteine del citoscheletro

38 Via Apoptotica Estrinseca La via estrinseca o pathway dei recettori di morte è attivata dalla famiglia dei recettori del TNF (tumor necrosis factor), la quale è composta da recettori che inoltre hanno un ruolo fondamentale nel mantenere l omeostasi cellulare e nel riconoscimento immunitario. L attivazione di questa via si ha quando un ligando di morte si lega al dominio extracellulare del suo recettore con conseguente attivazione delle caspasi iniziatrici. La famiglia di tali recettori è composta da diversi membri, i quali sono differentemente espressi nelle varie popolazioni cellulari. Questi recettori sono: - TNFR1 ( recettore del TNF) -CD95 (denominato anche Apo1 o Fas) -TRAIL-R1, -TRAIL-R2, NGFR

39 Death receptors and their ligands. Cystein-rich extracellular domains. 80 amino acid death domain motif in their cytoplasmic C-terminal region, which is crucial for transmitting apoptotic or other signals.

40 Via Estrinseca Questi recettori contengono un dominio citoplasmatico implicato nelle interazioni proteina-proteina detto DOMINIO DI MORTE (DD), indispensabile per liberare segnali apoptotici. I recettori meglio studiati sono quelli TNFR1 e del recettore Fas (CD95).

41 ATTIVAZIONE Quando il ligando (TNF; tumor necrosis factor o FasL; ligando del recettore Fas) si è associato alla porzione extracellulare del recettore, il recettore trimerizza e la porzione intracellulare, caratterizzata da un dominio DD (Death Domain), dirige la formazione di un complesso proteico denominato DISC (death-inducing signaling complex) mediante il reclutamento di una specifica proteina adattatrici FADD (Fas-associated death domain, per il Fas) o TRADD (TNFR-associated death domain) per il TNFR. Questa proteina trasporta un dominio DED (death effector domain) che permette di reclutare le pro-caspasi 8 e l attivano (induzione per prossimità). La caspasi-8 attivata agisce attivando la pro-caspasi 3 che agisce sui substrati sensibili.

42

43 In alcuni tipi cellulari le caspasi 8 non sono particolarmente efficaci nel clivaggio della caspasi 3 e quindi agiscono sulla proteina BID che troncata dalla caspasi 8, in forma corta (t-bid) trasloca nella membrana mitocondriale dove si lega ed attiva BAX e BAD. Questa attivazione permette la traslocazione di BAX nello strato esterno della membrana mitocondriale, causando l oligomerizzazione di BAX e BAD con conseguente rilascio di citocromo c ed inibizione delle IAP (inhibitor of apoptosis pathways) stabilendo un legame fra via estrinseca e via intrinseca.

44 La via mitocondriale L attivazione della via mitocondriale si attiva mediante una permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna con conseguente dissipazione del gradiente di protoni che è responsabile del potenziale transmembrana mitocondriale. La permeabilizzazione coinvolge anche la membrana mitocondriale esterna con conseguente perdita di proteine solubili, normalmente confinate negli spazio intermembranali dei mitocondri. QUALE MECCANISMO INDUCE LA PERMEABILIZZAZIONE?

45 La formazione di pori di transizione di membrana a livello mitocondriale coinvolge proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2 (es. Bax, tbid ) La permeabilizzazione della membrana interna avviene come conseguenza della formazione di pori non specifici (indotti da stimoli apoptotici). Canali anionici voltaggio-dipendenti (VCAD), che sono le proteine maggiormente presenti nella membrana mitocondriale esterna. In condizione normale questi canali sono permeabili a proteine con un peso molecolare fino a 5kD. La formazione dei pori di transizione di membrana nasce dalla fusione dei VCAD con i pori aspecifici (modello 2), sotto il controllo delle proteine della famiglia Bcl-2. QUALUNQUE SIA IL MODELLO, LA PERMEABILIZZAZIONE DELLE MEMBRANE MITOCONDRIALI INDUCONO LA FUORIUSCITA DEL CITOCROMO C NEL CITOPLASMA.

46 intermembrane space (IMS) proteins that directly bind XIAP and antagonize its ability to inhibit caspases

47 VIA INTRINSECA La via intrinseca è attivata da stress cellulari (deprivazione di fattori di crescita, ipossia, danno al DNA) o agenti antitumorali. Nelle cellule normali, il danno al DNA puo indurre due possibili reazioni; la riparazione e/o la tolleranza del danno, oppure la stimolazione della cascata di segnali che inducono la morte della cellula danneggiata. Nella trasformazione neoplastica queste reazioni sono normalmente alterate. Le principali lesioni letali al DNA sono le rotture del doppio filamento (double strand breaks; DSB), le quali sono riconosciute da proteine (chinasi) con capacità di riparazione. Una di queste proteine è ATM (ataxia telangiectasia mutated) attivata dopo lesione del DNA indotta da radiazioni ionizzanti. ATM induce la fosforilazione di diversi substrati coinvolti con il blocco del ciclo cellulare e nell induzione dell apoptosi (p53, CHK1, CHK2, p21). In base al danno o alla capacità di riparazione p53 puo indurre la trascrizione di geni pro-apoptotici (Bax, PUMA)

48

49 Via intrinseca Lo stimolo che induce la via intrinseca induce la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e rilascio del citocromo c che si lega al fattore Apaf-1 (apoptotic protese-activating factor-1) inducendo oligomerizzazione e cambiandone la sua conformazione. Questo cambiamento comporta l esposizione del DOMINIO DI RECLUTAMENTO DELLE CASPASI (ARD), in presenza di ATP. Apaf-1, è cosi in grado di reclutare ed attivare la pro-caspasi 9 formando un complesso chiamato APOPTOSOMA, il quale attiva la pro-caspasi 9, che a sua volta attiva le caspasi effettrici (3, 6, 7) con conseguente inizio dei fenomeni apoptotici (frammentazione del DNA, disgregazione del citoscheletro, ecc..).

50

51 Caspasi e HSP Hsp70 e Hsp27 agiscono sequestrando APAF-1 e Cit. C, prevenendo la maturazione della casp-9 e di conseguenza inibendo l apoptosi. L effetto inibitorio agisce anche a livello della cas-3

52 MODULATORI DELL APOPTOSI Localizzandosi sulla membrana esterna del mitocondrio, favoriscono (se proapoptotici) o rendono meno facile (se anti-apoptotici) la formazione di megacanali e la conseguente fuoriuscita di molecole pro-apoptotiche Sono strutturalmente simili tra loro (domini BH1-4 + dominio transmembrana) Anti-apoptotici: Bcl-2, Bcl XL, Pro-apototici: Bad, Bax, Bak, Bid Stimoli endogeni ed esogeni agiscono sulla propensione all apoptosi della cellula alterando la loro quantità, localizzazione e stato di attività

53 La famiglia Bcl-2 Il gene Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) fu identificato nelle cellule B del linfoma follicolare e la sua over-espressione antagonizza l induzione dell apoptosi mediata da diversi stimoli, compresi quelli da chemioterapici. La sua over-espressione in diversi tipi di tumore contribuisce alla crescita cellulare ed in combinazione con l over-espressione di altri oncogeni (c-myc), alla trasformazione neoplastica. Diversi membri della famiglia Bcl-2 sono stati identificati e caratterizzati per la loro funzione pro-apoptotica e quindi potenziali oncosoppressori (Bax, Bak, Bim, Bid.), o funzione anti-apoptotica e quindi potenziali oncogeni (Bcl-2, Bcl-XL,..). Inoltre il genoma di alcuni virus patogeni (Epstein-Barr, sarcoma di Kaposi virus) codificano per proteine simili a Bcl-2.

54 Le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 contengono quattro domini conservati BH (1-4), omologhi a Bcl-2, mentre i membri pro-apoptotici possono essere suddivisi in quelli con tre domini omologhi (Bax, Bak) o con solo il dominio BH3 conservato (Bid, Bim, Bad). Inoltre molti di questi membri contengono regioni carbossi-terminali che hanno affinità per le membrane, in particolare quella esterna dei mitocondri. In assenza di segnali di morte, molti membri pro-apoptotici sono localizzati nel citosol o nel citoscheletro e solo dopo segnali di morte assumono una modificazione conformazionale che li rende capaci di migrare verso le membrane mitocondriali. Le interazioni fra membri pro ed anti-apoptotici modula la redistribuzione del citocromo c nel mitocondrio.

55 a) Le proteine pro-apoptotiche possono essere suddivise in effettori (causano depolarizzazione) o solo BH3 (sensibilizzatori, trasmettono il segnale apoptotico agli effettori). b) Modello indiretto: BAX e BAD sono legati ed inibiti da Bcl-2 quando sono nello stato costitutivamente attivo e il legame di BH3 a Bcl-2 è sufficiente per liberare Bad/BAX. Modello diretto: Bad/Bax sono attivati da BH3 e Bcl-2 previene la depolarizzazione della membrana mitocondriale sequestrando BH3 o inibendo Bad/Bax attivati.

56 Bcl-2 modulano la morte cellulare La famiglia Bcl-2 modula la morte cellulare in parte influenzando il rilascio di citocromo c e diverse altre proteine, ma stabilizzano anche il potenziale transmembrana dei mitocondri regolandone il flusso protonico, inibendo la formazione di ROS e prevenendo l acidificazione citoplasmatica. Nel processo apoptotico Bax dimerizza e si inserisce nella membrana mitocondriale, alterandone la funzione. I vari membri della famiglia Bcl2, avendo dei domini proteici comuni possono formare omo o eterodimeri. La formazione di questo complessi permette di regolare la risposta pro od antiapoptotica. Bcl2-Bcl2: anti-apoptotica Bax-Bcl2: inattivo Bax-Bax: apoptotico L attività di Bcl-2 puo essere regolata da fosforilazione, con perdita della sua funzione antiapoptotica, da alcuni farmaci antitumorali che interagiscono con i monomeri di tubulina ed influenzano la polimerizzazione dei microtubuli.

57

58 VIA INTRINSECA Fattori stimolanti l apoptosi Le altre proteine pro-apoptotiche, (come BID), cooperano con BAX e BAD nell indurre il rilascio di citocromo c. Inoltre il dimeri Bax-Bid induce il rilascio di AIF (Apoptosis Inducing Factor) e Smac/DIABLO che blocca i fattori IAP (proteine inibitrici l apoptosi). AIF collabora nell indurre il rilascio di citocromo c, ma ha anche la capacità di traslocare nel nucleo ed indurre la condensazione della cromatina e l apoptosi mediante una via caspasi indipendente (attivazione di endonucleasi).

59 Inibitori dell apoptosi (IAP family) Le proteine IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) sono proteine altamente conservate e sono caratterizzate da almeno un dominio BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat). Questo dominio è presente in diverse proteine fra cui ciap1, ciap2, XIAP e Survivina. La maggior parte delle proteine IAP son altamente espresse nei tessuti embrionali e quasi assenti nelle cellule differenziate, mentre la loro espressione aumenta nelle cellule tumorali. Le IAP si legano e rendono inattive le caspasi, ma possono svolgere un ruolo inibitorio del processo apoptotico anche legandosi alle proteine pro-apoptotiche Smac/DIABLO (proteine che promuovono l attivazione delle caspasi, riducendo l inibizione delle caspasi IAP-mediata).

60

61 INIBITORI DELL APOPTOSI (cflip) Un altra proteina che regola negativamente l apoptosi interferendo con l attivazione delle caspasi è la proteina FLICE (cflip o usurpina), che contiene un dominio DED mancante del sito catalitico attivo e dei residui aminoacidici che formano il pacchetto di proteine necessarie (DISC) per attivare la pro-caspasi 8. Quindi cflip previene il legame delle pro-caspasi 8 al complesso formatosi dall attivazione dei death receptors.

62 Il citocromo c si lega ad APAF-1 monomero e ne induce la eptamerizzazione, formando l apoptosoma. Livelli fisiologici di ATP o trna bloccano il legame del citocromo c ad APAF-1 Citocromo c richiede una molecola di Fe, fornita dalla spazio intermembranale, per potersi legare ad APAF-1. La fosforilazione della caspasi-9 da parte delle chinasi cicline dipendenti (CDK)-B [ciclo cellulare] e ERK 1/2 [proliferazione], inibiscono la caspasi 9, mediante un meccanismo ancora sconosciuto.

63 APOPTOSI DOVUTA A DANNO DEL DNA La duplicazione cellulare è accuratamente regolata da un complesso di proteine che sono le cicline e le chinasi ciclina dipendenti (CDKs). Per evitare la replicazione di DNA danneggiato durante la fase S o la sua segregazione durante la fase M, l integrità del DNA è monitorata da una serie di vie di trasduzione del segnale che possono inibire la progressione del ciclo cellulare mediante inibitori che interagiscono con i complessi C/CDK, permettendo la riparazione del DNA. Questi controlli avvengono in due fasi del ciclo (G1 e G2). Il controllo del DNA nella fase G1 coinvolge due chinasi (ATR e ATM) che fosforilano p53 attivandolo o distaccando il suo inibitore MDM2. Il fattore trascrizionale p53 attiva la trascrizione di geni (p21) il cui prodotto inibisce la sintesi di cicline e la fosfoforilazione di Rb.

64 Regolazione trascrizionale dei Bcl-2 Un ultimo meccanismo che regola l espressione e la funzione di Bcl-2 è la sua regolazione trascrizionale. p53 si lega al promotore del gene Bax mentre down-regola l espressione di Bcl-2.

65

66 Il granzyme B, una caspasi già attiva, viene inserita da linfociti citotossici nella cellula bersaglio, inducendone l apoptosi

67 NF-kB ed Apoptosi Per quanto riguarda il ruolo del fattore trascrizionale NF-kB nell ambito del processo apoptotico, è ben descritto come NF-kB inibisca l apoptosi mediante attivazione di fattori anti-apoptotici della famiglia Bcl-2 (in particolare il gene Bcl-xL) o del gene FLIP (fattore inibitore dell apoptosi). Comunque in altre situazioni fisiologiche NF-kB induce la morte cellulare mediante aumento dell espressione di p53 o attivando l espressione dei geni per Fas o FasL. In sintesi il ruolo di NF-kB nel processo apoptotico sembra sia regolato dalla condizione fisiologica e dal tipo di popolazione cellulare.

68

69 Death-Receptor Dependent Pathway Il sistema Fas-FasL ha un ruolo importante nel normale sviluppo dei linfociti T e nell autodistruzione del linfociti T attivati, inoltre l interazione Fas-FasL è anche uno dei meccanismi con il quale le cellule citotossiche del sistema immunitario possono uccidere le cellule bersaglio esprimenti il recettore Fas. Mutazioni del gene Fas sono caratteristiche di alcuni tumori o patologie congenite (sindrome linfoproliferativa autoimmune). Nell ambito delle patologie tumorali, nelle quali il processo apoptotico è inibito, l uso di chemioterapici che inducono trimerizzazione del recettore Fas (quindi attivazione anche in assenza del ligando Fas-L) possono indurre apoptosi delle cellule tumorali.

70 Terapia oncologica Up-regolazione di Fas mediante chemioterapici Molti tipi di cellule tumorali hanno sviluppato meccanismi multipli per resistere alla morte cellulare Fas-indotta, come la: - - perdita dell espressione di Fas, - mutazione dei domini funzionali del recettore Fas, - over-espressione dei prodotti antiapoptotici della famiglia Bcl-2 - over-espressione di cflip, La terapia con farmaci che inducono l espressione del gene Fas (cycloeximide, actinomicina D, interferone g ) permette in parte di sensibilizzare le cellule all apoptosi FasL-indotta. L uso di FasL rimane comunque dannoso, in quanto induce apoptosi degli epatociti, i quali esprimono alti livelli di Fas.

71 Terapia oncologica TRAIL TRAIL: TNF-related apoptosis inducing ligand, è una proteina omologa a TNF e FasL, che si trova come proteina transmembrana o in forma solubile. I recettori per il TRAIL, includono due tipi di recettori (R1 e R2) con DD simili a quelli del Fas E TNF-R e un altro gruppo che non ha domini di morte citoplasmatici e quindi non Inducono morte una volta attivati (decoy receptor, R3 e R4). La somministrazione di TRAIL associata a chemioterapici induce in alcuni tipi di cellule Tumorali apoptosi, mediata dall attivazione dei R1 e R2 che inducono anche aumento dell espressione delle molecole pro-apoptotiche, FADD e procaspasi e diminuiscono i livelli di c-flip.

72 Therapeutic intervention points in the signaling pathways that mediate TRAIL-induced apoptosis. Intracellular pathways that culminate in apoptosis following TRAIL-R1 and -R2 ligation are illustrated. Blue arrows indicate apoptotic signaling pathways. Brown arrows indicate molecular intervention points for therapies that augment TRAIL-induced apoptosis. Red arrows indicate up- or down-regulation of specific molecular targets. HDACI (Histone deacetylase inhibitors).

73 Agenti pro-apoptotici come bersaglio il pathway estrinseco

74 AUTOFAGIA Autofagia (autodigestione) si riferisce a pathways cellulari che coinvolgono il trasporto di porzioni citoplasmatiche ai lisosomi. 1) vesicle nucleation (formazione di membrane (fagofori). 2) Allungamento delle vescicole e completamento (crescita e chiusura) ) Fusione dell autofagosoma con il lisosoma. 4) Lisi delle membrana dell autofagosoma e degradazione del suo contenuto 4

75 Autofagia aumenta : 1. Per turnover delle proteine e organelli citoplasmatici 2. Generazione intracellulare di nutrienti ed energia (es. durante il digiuno, riduzione di fattori di crescita, aumento della domanda bioenergetica) 1. Temperatura, concentrazione di O2, densità cellulare REGOLATORI CHIAVE DELL AUTOFAGIA: TOR kinase complex, Class III PI3K

76

77

78 L alterazione nei differenti speps dell autofagia ha diverse conseguenze: reduced off-rate: risulta in una degradazione lisosomiale compromessa, con accumulo di autofagosomi. decreased on-rate: nei difetti (mutazioni, delezioni) di geni ATG si ha riduzione di vacuoli autofagici e accumulo di proteine aggregate e danni agli organuli intracellulari.

79 Fluorescence microscopy (Acidotropic dyes) Lysotracker Red Weakly basic amines selectively accumulate in cellular compartments with low internal ph and can be used to investigate the biosynthesis of lysosomes.

80 Invecchiamento cellulare L invecchiamento è un processo determinato esclusivamente da FATTORI GENETICI (teoria genetica) L invecchiamento dipende da eventi casuali che colpiscono gli organismi viventi nel corso della loro esistenza (Teoria Stocastica) fattori esogeni + fattori endogeni

81 LE CARATTERISTICHE DELL INVECCHIAMENTO Le caratteristiche sono: 1. Instabilità genomica 2. Logoramento dei telomeri 3. Alterazioni epigenetiche 4. Perdita di proteostasi 5. De-regolazione dell assorbimento di nutrienti 6. Disfunzioni mitocondriali 7. Senescenza cellulare 8. Esaurimento cellule staminali 9. Alterazione della comunicazione intercellulare

82 Instabilità genomica Accumulo di danni genetici durante la vita: 1. Mutazioni puntiformi 2. Traslocazioni geniche 3. Perdita o guadagno di cromosomi 4. Dis-regolazione genica causata da integrazione virale o trasposoni DDR: DNA Damage Response meccanismi in grado di controllare e riparare i danni

83 Alterazioni epigenetiche I cambiamenti epigenetiche coinvolgono alterazioni nella metilazione del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni e rimodellamento della cromatina. H4K16: istone acetilasi H4K20: trimetilazione H3K9: metilazione SIR2: deacetilasi Sono geni, considerati markers epigenetici, associati all invecchiamento

84 Logoramento dei telomeri I telomeri sono legati ad un complesso multiproteico denominato Shelterin e il logoramento dei telomeri è associato a perdita della funzionalità di questo complesso proteico. In modelli sperimentali (loss of Function) si ha un rapido declino della rigenerazione tissutale ed un acceleramento dei processi d invecchiamento

85 Perdita di Proteostasi Perdita dei meccanismi di controllo della qualità, stabilità e funzionalità. Questi sistemi funzionano in modo coordinato per ristabilire la struttura delle proteine appaiate in modo non corretto, rimuovere e degradare quelle danneggiate

86 Disfunzioni mitocondriali

87 De-regolazione dell assorbimento di nutrienti L asse somatotropico, comprende il GH, prodotto dall ipofisi anteriore e il mediatore secondario IGF-1 (prodotto da molti tipi celluari). IGF-1 signaling è fortemente correlato con l invecchiamento, in particolare attraverso FOXO e mtor. Polimorfismi o mutazioni che riducono il sistema IGF sono correlati con la longevità (pathways trofici e bioenergetici). La restrizione calorica è correlata all invecchiamento normale e alla longevità.

88 Senescenza cellulare La senescenza cellulare è definita come l arresto stabile del ciclo cellulare accoppiata a cambiamenti fenotipici. La senescenza è causata dall accorciamento dei telomeri e da fenomeni indipendenti dai telomeri. Danni al DNA e de-repressione del locus INK4/ARF avvengono progressivamente e cronologicalmente con l invecchiamento

89 Senescenza cellulare Le cellule in senescenza in un tessuto sono circa un 20% (analisi del DNA danneggiato e della beta-galattosidasi (SABG)) Quindi la senescenza cellulare non è un concetto generalizzato di tutti i tessuti di un organismo Le cellule in senescenza sono soggette a immunosorveglianza e fagocitate. La senescenza, previene la propagazione di cellule danneggiate e stimola il sistema immunitario. Quindi la senescenza è una risposta compensatoria che contribuisce a proteggere i tessuti da cellule danneggiate e cellule tumorali

90 Delezione di INK4/ARF BubR1 progeroid mouse BubR1 progeroid mouse lacking p16ink4a SABG staining

91 Meccanismi attraverso cui la rimozione delle cellule in senescenza dai tessuti invecchiati puo influire sulla funzionalità tissutale. Le cellule invecchiate mantengono comunque caratteristiche e danni anche in assenza di cellule in senescenza, dimostrando che i tessuti non possono regredire a condizioni preinvecchiamento.

92 Metodi per analizzare l attività della SA-βgal Cytochemical assay uses the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3- indoyl β-dgalactopyranoside (X-gal), which yields an insoluble blue compound when cleaved by β-galactosidase. Fluorescence-based assay, coupled to flow cytometry, provides a quantitative measure of βgal activity for each cell in the population. Cells are incubated with C12FDG, a β-galactosidase substrate that becomes fluorescent after cleavage by the enzyme. This procedure can be done using living cells, and SA-βgal positive cells can be detected and quantified by flow cytometry.