ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ. Osservazioni di osso equino al microscopio elettronico a scansione e alla microtomografia 3D

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1 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ Osservazioni di osso equino al microscopio elettronico a scansione e alla microtomografia 3D Rossella Bedini (a), Pietro Ioppolo (a), Raffaella Pecci (a), Perla Filippini (a), Salvatore Caiazza (a), Alessandra Bianco (b), Gioele Columbro (b) (a) Dipartimento di Tecnologie e Salute, Istituto Superiore di Sanità, Roma (b) Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università degli Studi Tor Vergata, Roma ISSN Rapporti ISTISAN 05/37

2 Istituto Superiore di Sanità Osservazioni di osso equino al microscopio elettronico a scansione e alla Microtomografia 3D. Rossella Bedini, Pietro Ioppolo, Raffaella Pecci, Perla Filippini, Salvatore Caiazza, Alessandra Bianco, Gioele Columbro 2005, 38 p. Rapporti ISTISAN 05/37 Lo scopo di questo lavoro è di analizzare innesti per ricostruzioni ossee provenienti da tessuto osseo equino, prodotto industrialmente, attraverso immagini microtomografiche e immagini al microscopio elettronico a scansione (Scanning Electron Microscope, SEM). Tali campioni sono stati opportunamente trattati dall azienda produttrice: sono stati deantigenati e solo alcuni demineralizzati. L analisi è volta a valutare la qualità del sistema di deantigenizzazione e demineralizzazione effettuate, a misurare la porosità dei campioni e a valutare la nuova metodica microtomografica. La tecnica di microtomografia tramite strumentazione Skyscan 1072 permette osservazioni strutturali senza nessun trattamento particolare del campione oppure alterazioni o danneggiamento dello stesso. Inoltre è possibile effettuare una acquisizione con ricostruzione 3D delle condizioni del campione, sia prima che dopo un test o un impianto, per esempio, in animale, poiché tale tecnica non altera in nessun modo l oggetto indagato. Dai risultati ottenuti emerge che la tecnica di microtomografia 3D, tramite strumentazione Skyscan 1072, è da considerarsi una valida e sostanziale alternativa all osservazione effettuata con microscopio elettronico a scansione. Parole chiave: Osso equino, Ricostruzioni ossee, Microtomografia, SEM Istituto Superiore di Sanità Scanning electron microscope and 3D microtomography observations of equine bone. Rossella Bedini, Pietro Ioppolo, Raffaella Pecci, Perla Filippini, Salvatore Caiazza, Alessandra Bianco, Gioele Columbro 2005, 38 p. Rapporti ISTISAN 05/37 (in Italian) The aim of this work was to analyze some grafts for bone reconstructions from equine bone tissue, industrially producted, by means of 3D micro-tomography and Scanning Electron Microscope (SEM) images. These samples have been treated by the manufacturer in a suitable way: they have been deantigenized and some of them have been demineralized. In order to evaluate the quality of the deantigenization and demineralization system the analysis was made, to measure the porosity of the samples and to estimate the new micro-tomographyc method. The 3D microtomography technique with Skyscan instrumentation allows to perform structural observations without any particular treatment, alteration or damaging of the sample. Moreover it is possible to perform an acquisition with a 3D reconstruction of the sample, both before and after a test or an implant, for example, into an animal, because this technique does not alter the tested object in any way. Results show that the 3D micro-tomography technique, with Skyscan 1072 instrumentation, could be considered as a valid and effective alternative to the SEM observation. Key words: Equine bone, Bone reconstructions, Micro-tomography, SEM Per informazioni su questo documento scrivere a: allessor@iss.it. Il rapporto è accessibile online dal sito di questo Istituto: Presidente dell Istituto Superiore di Sanità e Direttore responsabile: Enrico Garaci Registro della Stampa - Tribunale di Roma n. 131/88 del 1 marzo 1988 Redazione: Paola De Castro, Sara Modigliani e Sandra Salinetti La responsabilità dei dati scientifici e tecnici è dei singoli autori. Istituto Superiore di Sanità 2005

3 Rapporti ISTISAN 03/xxxx INDICE 1. Generalità sulle ricostruzioni ossee Tessuto osseo Fratture e loro guarigione Biomateriali per ricostruzioni ossee Biocompatibilità Raggi X Composizione dello spettro Spettro continuo Spettro caratteristico Interazione con la materia Microtomografia computerizzata tridimensionale a raggi x Caratteristiche della radiazione utilizzata Il rilevatore Ricostruzione di un immagine tomografica Immagini digitali: caratteristiche, acquisizione, qualità, elaborazione Caratteristiche Acquisizione Qualità e rapporto segnale/rumore Elaborazione Caratteristiche e applicazioni principali Microscopia elettronica a scansione Analisi chimica qualitativa e quantitativa con la tecnica EDAX Analisi morfologiche al SEM Conclusioni Indagini sperimentali Materiali e metodi Morfologia e caratteristiche dell osso equino Risultati Discussione Conclusioni Bibliografia i

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5 1. GENERALITÀ SULLE RICOSTRUZIONI OSSEE 1.1. Tessuto osseo Il tessuto osseo è una forma specializzata di tessuto connettivo, caratterizzata dalla mineralizzazione della matrice extracellulare. Esso è costituito da cellule e da matrice intercellulare. La matrice organica è formata di fibre collagene (collagene di tipo I) immerse in una matrice amorfa. La matrice amorfa contiene altre glicoproteine, quali proteine di adesione, osteocalcina (un prodotto specifico degli osteoblasti), osteonectina, BMP, piccoli proteoglicani. La matrice minerale dell osso ha composizione simile all idrossiapatite. L osso deve la sua robustezza alle fibre collagene e la sua durezza ai sali minerali. All esame ad occhio nudo si possono distinguere due tipi di osso: l osso spugnoso, che ha un aspetto alveolare ed è costituito da una rete tridimensionale di sottili trabecole nelle cui maglie intercomunicanti è accolto il midollo osseo, e l osso compatto, che appare invece come una solida massa eburnea. Le epifisi delle ossa lunghe sono formate da osso spugnoso ricoperto da un sottile strato periferico di osso compatto, mentre la diafisi appare come un cilindro cavo la cui parete, formata da osso compatto, circoscrive una cavità midollare centrale. La superficie esterna non-articolare delle ossa è rivestita da una guaina connettivale, il periostio; uno strato di cartilagine ialina, la cartilagine articolare, riveste invece le superfici articolari. Nelle ossa in accrescimento un disco di cartilagine, la cartilagine di coniugazione, separa l epifisi dalla diafisi. L esame microscopico dell osso maturo mostra che esso è organizzato in lamelle distinte, spesse circa 5 nm (tessuto osseo lamellare). Ciascuna lamella è costituita da cellule e da sostanza intercellulare; le fibre collagene sono orientate nella stessa direzione in una determinata lamella e in direzioni diverse in lamelle contigue. Le cellule (osteociti) sono accolte in cavità lenticolari, le lacune ossee, scavate nella matrice calcificata. Dalle lacune si irradiano canalicoli ossei ramificati che si anastomizzano con quelli delle lacune vicine, fino a raggiungere le cavità midollari o i canali vascolari. Nell osso compatto sono infatti presenti canali vascolari orientati più o meno perpendicolarmente tra loro: canali di Havers e canali di Volkmann. Le lamelle dell osso compatto formano tre tipi diversi di strutture. Gli osteoni, o sistemi haversiani, sono formati da un canale (di Havers) orientato parallelamente all asse maggiore dell osso, circondato da una serie di lamelle concentriche. I sistemi interstiziali sono dei residui di osteoni riassorbiti, e si formano nel corso del rimodellamento osseo. Alla superficie esterna dell osso e alla sua superficie interna, al di sotto dell endostio, vi sono alcuni strati di lamelle disposti circolarmente, a formare i sistemi circonferenziali, esterno e interno. I sistemi lamellari dell osso spugnoso non formano strutture organizzate, ma semplici trabecole. L aspetto microscopico del periostio è quello di una guaina di connettivo denso, ancorata sull osso sottostante mediante fibre collagene perforanti (di Sharpey). Le cellule dello strato interno del periostio mantengono potenzialità osteogeniche. L endostio appare come una sottile lamina di cellule pavimentose che riveste tutte le cavità interne delle ossa. 1

6 Il tessuto osseo immaturo che forma lo scheletro del feto differisce da quello dell adulto: le fibre collagene non formano fasci paralleli organizzati in lamelle, ma fasci intrecciati (osso non lamellare, a fibre intrecciate). Nel corso del rimodellamento questo tessuto osseo immaturo gradatamente rimosso per fare posto alla cavità del midollo osseo, o sostituito dal tessuto lamellare, a fibre parallele. Nel rimodellamento si verificano simultaneamente processi di riassorbimento e di deposizione di nuovo tessuto osseo. I processi di rimodellamento dell osso continuano poi per tutta la vita. Nelle ossa in accrescimento si distinguono quattro tipi cellulari. Le cellule osteoprogenitrici sono le cellule staminali del tessuto osseo, che permangono anche nell adulto sulle superfìci libere dell osso maturo; esse derivano dalla cellula mesenchimale e non sono morfologicamente distinguibili dai comuni fibroblasti. Gli osteoblasti sintetizzano i componenti organici della matrice e regolano anche la deposizione di sali minerali. Sono cellule cuboidali, basofile, localizzate in corrispondenza delle superfìci in via di espansione delle ossa. Gli osteociti sono le cellule più numerose dell osso maturo; sono cellule quiescenti, accolte nelle lacune ossee e fornite di prolungamenti citoplasmatici; sono nutriti tramite la rete di canalicoli e di canali vascolari scavati nella matrice. Gli osteoclasti sono sincizi polinucleati forniti di attività erosiva verso la matrice ossea, accolti in fossette scavate sulla superficie della trabecola ossea, le lacune di Howship. La superficie degli osteoclasti rivolta verso l osso presenta un orletto striato costituito da esili prolungamenti citoplasmatici. Gli osteoclasti appartengono alla famiglia dei monociti - macrofagi, il cui differenziamento in osteoclasti ne richiede un interazione diretta con gli osteoblasti. Il riassorbimento osseo comporta una sequenza di eventi che inizia con l adesione degli osteoclasti alla matrice (mediata da integrine) e la delimitazione di un microambiente in cui si svolgerà l azione erosiva. Il microambiente viene acidificato ad opera di una pompa protonica situata nella membrana dell orletto striato. Il ph acido solubilizza i sali minerali, esponendo la matrice organica alla digestione operata da enzimi (una proteasi lisosomale e una collagenasi) rilasciati dall osteoclasto. L osso origina sempre da un tessuto mesenchimale preesistente. Si riconoscono due tipi di osteogenesi: intramembranosa (o diretta) e endocondrale (o indiretta). Nella prima, che riguarda le ossa della volta del cranio e parte delle ossa della faccia, l osso si forma direttamente in seno al mesenchima per differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti. Questi cominciano a secernere una densa matrice eosinofila ricca di fibre collagene e si dispongono a ridosso dello strato di tessuto osteoide neoformato, inizialmente privo di sali minerali, che subisce presto la mineralizzazione. Il tessuto osseo membranoso immaturo è di tipo spugnoso, con trabecole di osso non lamellare che delimitano lacune inizialmente occupate da mesenchima e successivamente da tessuto emopoietico. Il successivo rimaneggiamento dell osso immaturo porta alla formazione di osso (spugnoso e compatto) di tipo lamellare. Nell ossificazione indiretta l osso è invece preceduto da un modello cartilagineo che viene poi sostituito da tessuto osseo: le ossa della base del cranio, della colonna vertebrale, del torace, del bacino e degli arti sono per tale motivo denominate ossa condrali o ossa di sostituzione. Tutti i centri primari di ossificazione endocondrale compaiono nelle diafisi entro il terzo mese di vita intrauterina. I centri di ossificazione delle epifisi {centri secondari) compaiono molto più tardivamente. L inizio dell ossificazione endocondrale è segnato dalla proliferazione e successiva ipertrofia dei condrociti. Le cellule cartilaginee ipertrofiche secernono il fattore angiogenico VEGF, che induce la gemmazione di vasi dal pericondrio e li attrae verso il centro di ossificazione. Come conseguenza dell ipertrofìa delle cellule (che subito dopo muoiono per apoptosi), le lacune 2

7 cartilaginee si ingrandiscono a spese della matrice circostante, che gradualmente si assottiglia. La matrice cartilaginea ialina residua si calcifica per deposizione di sali di calcio e viene poi parzialmente riassorbita dai condroclasti, con formazione di cavità che vengono occupate dall invasione vascolare e dal mesenchima. Dal mesenchima si differenziano quindi osteoblasti, che si ancorano sulla superficie delle spicole di cartilagine calcificata e cominciano a secernere matrice osteoide. Contemporaneamente a queste modificazioni riguardanti la diafisi le cellule dello strato profondo del pericondrio si differenziano in osteoblasti e depositano attorno alla diafisi un sottile strato di tessuto osseo, il manicotto o collare periostale. Il collare periostale si forma per ossificazione membranosa e diventa progressivamente più spesso a mano a mano che l ossificazione procede. L accrescimento in lunghezza di un segmento scheletrico dipende dalla presenza della cartilagine di coniugazione. Per tutto il periodo di sviluppo questa continua ad allungarsi per accrescimento interstiziale dal lato rivolto verso l epifisi e ad essere contemporaneamente sostituita da osso dal lato rivolto verso il centro diafisario (metàfisi). Nella cartilagine di coniugazione si può identificare l ordinata sequenza delle tappe dell ossificazione endocondrale, sotto forma di zona della cartilagine in riposo, zona di proliferazione, zona di ipertrofia, zona della cartilagine calcificata, zona di invasione vascolare e di deposizione di osso. Allorché, nell adulto, i condrociti del disco epifisario cessano di proliferare, il processo di ossificazione procede fino alla sostituzione completa della cartilagine del disco (chiusura dell epifisi). La mineralizzazione della matrice ossea si svolge in tre fasi: la prima fase è caratterizzata dalla comparsa nella matrice di minuti globuli calcificanti (o vescicole della matrice), rilasciati da condrociti, osteoblasti e odontoblasti, che costituiscono la sede iniziale di mineralizzazione della matrice. Un secondo stadio porta all accrescimento dei nuclei fino alla formazione di strutture cristalline orientate; segue infine una terza fase, di coalescenza delle aree mineralizzate, in intimo rapporto con le fibre collagene. Il controllo della formazione e del rimodellamento del tessuto osseo risulta dalla interazione di molti fattori. L ormone paratiroideo agisce sugli osteoblasti (e, per loro tramite, indirettamente anche sugli osteoclasti), sul rene e sulla produzione di vitamina D. Il paratormone, oltre che stimolare indirettamente il riassorbimento della matrice ossea, come detto sopra, ha anche l effetto di impedire l apoptosi degli osteoblasti, con conseguente aumento della produzione di matrice ossea. La calcitonina inibisce invece l attività degli osteoclasti. L uso terapeutico della calcitonina è però ostacolato dal fatto che le cellule esposte all ormone perdono il recettore stesso. Vari ormoni sistemici, fattori di crescita e sali minerali parimenti giocano un ruolo nell istogenesi ossea. Un eccesso di ormoni glucocorticoidi provoca ad esempio una riduzione dell assorbimento intestinale di calcio e fosfato e un aumento della loro escrezione renale. Poiché i glucocorticoidi inducono anche apoptosi negli osteoblasti, il risultato è una diminuzione della massa ossea totale (osteoporosi). Gli ormoni tiroidei sono essenziali per un normale accrescimento osseo, in particolare nello stimolare la maturazione della cartilagine del disco epifìsario. Anche se gli ormoni sessuali appaiono essere importanti regolatori dell accrescimento e del ricambio scheletrico, poco si conosce sul loro meccanismo d azione, che è probabilmente indiretto. Lo sviluppo delle ossa è influenzato anche da altri ormoni (per es. l ormone della crescita, GH, o ormone somatotropo, che stimola la proliferazione della cartilagine di coniugazione) e da vitamine (A, C e D). 3

8 Infine, anche alcuni ioni appaiono avere un ruolo nella regolazione funzionale delle cellule ossee. Il calcio può ad esempio intervenire nel metabolismo osseo principalmente controllando la secrezione degli ormoni calcio-regolativi (1) Fratture e loro guarigione Una frattura dell osso è semplicemente una soluzione della sua continuità. Esistono vari tipi di fatture. Una frattura semplice è quella nella quale la pelle resta intatta sulla zona di frattura dell osso. Si parla di frattura composta allorché è presente anche una ferita dei tessuti molli che può essere causata da uno dei monconi che perfora la cute o dall agente (per esempio un proiettile) che ha causato la frattura. Una frattura a legno verde è quella nella quale un lato dell osso è rotto o scheggiato e l altro lato è solo piegato. Una frattura completa comporta la rottura trasversale dell osso a tutto spessore. Una frattura epifisaria si realizza tra epifisi e diafisi dell osso. Una frattura comminuta è quella nella quale si forma un certo numero di frammenti a causa di uno schiacciamento o della scheggiatura dell osso. Se le estremità fratturate di un osso vengono poste a contatto e immobilizzate, si verifica il normale processo di guarigione. Al momento della frattura alcuni vasi vengono rotti e fanno fuoriuscire del sangue attorno alle estremità fratturate dell osso; si forma un coagulo che viene invaso da cellule connettivali le quali formano tessuto di granulazione e nuovi capillari. Gli osteoblasti del periostio, posti sulla superficie dell osso, e quelli dell endostio che riveste le cavità midollari e i canali di Havers si moltiplicano rapidamente e producono una certa quantità di tessuto osteoide detto callo. Questo tessuto colma la distanza tra i monconi dell osso, riempie le cavità midollari per una certa misura e circonda completamente le estremità lese dell osso, formando una struttura efficace che solitamente impedisce i movimenti tra i segmenti. Appena il callo viene mineralizzato, si trasforma in osso vero e proprio. Il processo di guarigione viene poi completato dalla riorganizzazione del callo per formare la tipica diafisi dell osso con la relativa cavità midollare. Un cattivo allineamento delle ossa fratturate può essere in parte corretto dall azione degli osteociti e degli osteoclasti che rimuovono anche gli accrescimenti eccessivi del callo osseo. Non appena l osso viene di nuovo impiegato, inizia l orientamento funzionale del callo con una tendenza a raddrizzare le imperfezioni nell allineamento dell osso. Il callo aumenterà nel lato concavo ove lo stress è più forte, e tenderà ad essere eroso nel lato convesso, con il risultato di una correzione delle deformazioni. Il grado di correzione spontanea possibile nelle fratture dipende da un certo numero di fattori, tra cui l età, la vascolarizzazione dell osso, l entità della correzione necessaria, la presenza o meno di infezioni e il grado di danno subito dai tessuti circostanti. L eccessiva separazione dei frammenti, che può essere causata da una esagerata trazione sui monconi o da immobilizzazione inefficace della frattura, può esitare in una mancata unione e la distanza fra i frammenti viene colmata da tessuto fibroso. Le guarigioni più rapide avvengono in giovane età se il punto di frattura è ben vascolarizzato ed è completamente immobilizzato con le estremità dei frammenti ben apposti. Nella specie umana, per esempio, una frattura può guarire completamente in un mese in un bambino, ma in un tempo di molto più lungo in una persona che abbia superato la mezza età. A volte un osso può venire riparato innestando un altro pezzo di osso nella stessa area. 4

9 Se l osso impiantato appartiene alla stessa specie e, più ancora, se appartiene allo stesso animale, la porzione di osso dell innesto a contatto con i liquidi corporei può sopravvivere e i suoi osteoblasti possono attivarsi. Nello stesso tempo gli osteoclasti provvedono a rimuovere le parti morte che vengono sostituite con osso neo-formato se l innesto è funzionale e sottoposto alla giusta quantità di stress. Se l innesto proviene da un animale appartenente a specie diversa, tutti i suoi osteoblasti muoiono perché l organismo ricevente tende a rifiutare tutte le proteine estranee (2) Biomateriali per ricostruzioni ossee Un biomateriale è un materiale progettato per interagire con sistemi biologici per valutare, trattare, incrementare o sostituire tessuti, organi o funzioni corporee (3). Molti materiali sono attualmente in uso come biomateriali e, considerando la loro natura chimica, possono essere suddivisi in: metalli, polimeri sintetici, ceramici (cristallini, porosi, a base di fosfato di calcio), compositi, materiali di origine biologica. Nelle ricostruzioni ossee i materiali artificiali utilizzati sono i ceramici porosi e i ceramici a base di fosfato di calcio. L utilizzo di materiale poroso prevede la crescita del tessuto in rigenerazione all interno dei pori. L impianto, quindi, serve ad immobilizzare le estremità fratturate e funge da supporto per la ricrescita dell osso. Esso può anche essere studiato per essere un supporto attivo e quindi stimolare la ricrescita ossea. Si può anche progettare il materiale in modo che esso venga degradato in un determinato periodo di tempo e venga sostituito dal materiale naturale del tessuto ospite. Questa, se lo consentono i requisiti di resistenza meccanica e di performance a breve termine, rappresenta la soluzione ottimale per un biomateriale per ricostruzioni ossee poiché i tessuti naturali possono ripararsi e sostituirsi da soli nel corso della vita. Quindi, bomateriali riassorbibili sono basati su principi biologici di riparazione tissutale evolutisi nel corso di milioni di anni. Condizioni necessarie che i materiali bioriassorbibili devono soddisfare sono: mantenimento della resistenza meccanica e stabilità interfacciale durante il periodo di degradazione e sostituzione da parte del tessuto ospite naturale; la loro velocità di riassorbimento deve essere paragonabile alla velocità di ricrescita del tessuto; poiché grandi quantità di materiale devono essere sostituite, il biomateriale riassorbibile deve essere composto solo da sostanze metabolizzabili. In questi particolari impianti, l interfaccia tessuto-biomateriale è costituita dal tessuto vivente presente all interno dei pori. Per questo motivo ci si riferisce a questo tipo di adesione col termine fissazione biologica. Inoltre, affinché il tessuto interporoso rimanga vivo, è necessario garantire sufficiente apporto sanguigno. Quindi, per ottenere una corretta proliferazione vascolare è necessario che il diametro dei pori non sia inferiore a 100 µm. Come già detto, materiali artificiali in uso per questo tipo di applicazione sono i ceramici porosi e i ceramici a base di fosfato di calcio porosi. Questi sono utilizzati prettamente per impianti non sollecitati meccanicamente poichè la resistenza meccanica decresce rapidamente all aumentare della porosità, oppure in impianti dove la crescita dell osso agisce da fase di rinforzo. Non vengono utilizzati materiali metallici porosi perché l incremento di area superficiale potrebbe costituire un focolaio per l innesco del processo corrosivo dell impianto che porterebbe al conseguente rilascio di ioni non metabolizzabili nel tessuto. 5

10 Per questo tipo di applicazioni si può ricorrere anche a materiali biologici e quindi si possono avere impianti di tessuto osseo proveniente dal paziente stesso (impianti autologhi), da essere vivente della stessa specie (impianti omologhi) o di specie diversa (impianti eterologhi). I più diffusi tra questi sono quelli eterologhi per ovvi motivi di disponibilità del tessuto da impiantare. Il tessuto proveniente da animale, per essere impiantato e tollerato dall ospite, deve essere sottoposto ad opportuni trattamenti. Il processo di trattamento prevede la deantigenizzazione del tessuto che è finalizzata alla eliminazione delle proteine solubili. Ciò è necessario perché le proteine solubili potrebbero funzionare da antigeni per il sistema immunitario dell ospite, scatenando quindi una risposta dell organismo che porterebbe al fallimento dell impianto. La deantigenizzazione può essere compiuta esponendo il campione ad opportuni agenti chimici o enzimatici ad una determinata temperatura. Il processo di trattamento del tessuto potrebbe prevedere anche la sua demineralizzazione o idratazione/disidratazione. I trattamenti opportuni da effettuare sono scelti in base al tipo di applicazione del dispositivo. Impianti eterologhi possono anche essere progettati per essere bioriassorbiti dall ospite. Infatti, qualsiasi superficie ossea esposta ai fluidi tessutali tende ad erodersi se non è ricoperta da cellule osteogeniche. Tuttavia, tutti i materiali elencati fino ad ora presentano problemi relativi alla biocompatibilità (4) Biocompatibilità La biocompatibilità è definita come la capacità di un materiale di essere utilizzato per una specifica applicazione ottenendo una risposta idonea dal sistema ospite (3). La risposta biologica innescata da biomateriali e dispositivi è controllata principalmente dalla composizione chimica dello strato superficiale. La regione superficiale è caratterizzata da elevata reattività dovuta alla presenza di siti di legame liberi. Essa è quindi soggetta alla presenza di contaminanti. Gli eventi immediatamente successivi ad un impianto sono in ordine cronologico: adsorbimento di proteine; adesione cellulare; attivazione cellulare. L adsorbimento di proteine comporta la formazione di uno strato proteico che aderisce alla superficie del biomateriale. La natura dello strato proteico dipende dalle proprietà superficiali dell impianto, dalle proprietà e affinità per la superficie delle proteine disperse nell ambiente circostante e dalla organizzazione delle proteine adsorbite. Lo strato proteico che si forma non è una struttura statica, ma dinamica con variazione nel tempo dei tipi proteici, conformazione e composizione. Le proteine adsorbite sul substrato solido subiscono comunque delle variazioni nella loro struttura tridimensionale. Inoltre si ritiene che le proteine presenti sulla superficie non sono libere di ruotare poiché l adsorbimento coinvolge numerosi legami con la superficie solida. Sembra poi che l orientazione sia la stessa per tutte le proteine dello stesso tipo. Le caratteristiche dello strato adsorbito rispecchiano le proprietà di superficie del materiale. In seguito alla interazione con proteine solubili, la superficie del materiale estraneo diventa biologicamente attiva poiché lo strato adsorbito induce una risposta cellulare specifica alla superficie dell impianto che determinerà il grado di biocompatibilità di quest ultimo. Dopo la formazione dello stato proteico, nel sito dell impianto arrivano cellule per diffusione, 6

11 convezione, o locomozione. Le cellule che arrivano vedono essenzialmente lo strato proteico interfacciale, anche se esse, in realtà, possono entrare in contatto diretto col materiale mediante pseudopodi che attraversano lo strato proteico preadsorbito o consumando le proteine immobilizzate sulla superficie. Una volta raggiunto il sito dell impianto, le cellule aderiscono allo strato proteico e tale processo è mediato da recettori specifici per le proteine adsorbite. L adesione cellulare avviene principalmente tramite contatti focali e close contact (mediati da specifiche proteine adesive come la fibronectina). Il legame ligando-recettore induce un cambio conformazionale delle proteine transmembrana della cellula innescando una specifica risposta biochimica. In questo modo le cellule vengono attivate e l effetto finale può essere: modificazione della forma della cellula e della morfologia della membrana plasmatica; rilascio di granuli citoplasmatici; espressione di selectine, moltiplicazione e organizzazione in tessuto. Tali processi cellulari determinano la risposta dell ospite all impianto e questa può portare all integrazione del dispositivo nel tessuto ospite (elevata biocompatibilità) o al suo rigetto (scarsa biocompatibilità). Per un impianto per ricostruzione ossea si può parlare anche di biocompatibiltà meccanica. Il concetto di biocompatibilità meccanica è relativo al diverso modo di deformazione dell ospite e della protesi. Il loro diverso modulo di elasticità provoca diverse deformazioni nei due mezzi, e ciò causa movimenti relativi sia in fase di applicazione che in fase di rilascio della sollecitazione. Se questi movimenti non rimangono in campo elastico, si possono creare tensioni residue in grado di provocare scorrimenti relativi tra le superfici, necrosi del tessuto osseo, mobilizzazione della protesi e, conseguentemente, rimozione di quest ultima. Con opportune modificazioni superficiali è possibile migliorare la biocompatibilità di un impianto mantenendo inalterate le sue proprietà meccaniche e funzionalità. Tali modificazioni prevedono il controllo del livello di contaminazione della superficie in modo da evitare la presenza di contaminanti indesiderati. Per dispositivi per ricostruzioni ossee è possibile far adsorbire sulla loro superficie, anticipatamente al loro innesto, fattori di crescita del tessuto osseo, in modo da promuovere la riformazione del tessuto naturale. Tuttavia, nonostante la possibilità di effettuare tali modificazioni superficiali, i materiali che risultano più biocompatibili sono quelli di natura biologica. Essi hanno anche il vantaggio di presentare una elevatissima biocompatibilità meccanica. Per ovvi motivi di disponibilità, gli impianti più frequenti sono quelli eterologhi. Fino a qualche anno fa i materiali per impianti eterologhi provenivano dai bovini; recentemente il tessuto bovino non è più utilizzato a causa della epidemia spongiforme bovina (Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE). Il problema viene aggirato usando tessuto equino, che viene impiegato nella formazione di supporti (scaffold) per ricostruzioni ossee (4). 7

12 2. RAGGI X Ai tempi di Maxwell, la luce e le adiacenti radiazioni infrarossa e ultravioletta erano i soli tipi di radiazione elettromagnetica noti. Oggi lo spettro elettromagnetico comprende un grande intervallo di tipi diversi di radiazioni originati da un grande numero di sorgenti differenti. Dalla teoria di Maxwell si conclude che, anche se queste radiazioni sono molto diverse per quanto riguarda le loro proprietà, il modo di produrle e il modo in cui si possono osservare, esse hanno molte caratteristiche in comune: tutte possono essere descritte in termini di campi elettrici e magnetici, e tutte si propagano attraverso il vuoto alla stessa velocità (la velocità della luce). In effetti, dal punto di vista fondamentale, esse differiscono unicamente per la lunghezza d onda o la frequenza. Nello studio della struttura dei materiali, le radiazioni utilizzate hanno lunghezza d onda caratteristica dei raggi X che è compresa tra ηm. I raggi X possono essere prodotti a lunghezze d onda discrete in transizioni atomiche tra gli elettroni più interni di un atomo (i più fortemente legati) e possono essere prodotti anche quando particelle cariche (come gli elettroni) vengono decelerati. Le lunghezze d onda dei raggi X corrispondono circa alla distanza tra gli atomi dei solidi; perciò la diffusione dei raggi X da parte dei materiali è un modo utile per studiare la loro struttura. Al contrario di altri tipi di onda, come le onde acustiche, i raggi X non hanno bisogno di un mezzo per propagarsi e hanno alcune proprietà fondamentali: per essi vale la relazione v=λν, essendo v la velocità, λ la lunghezza d onda, ν la frequenza; si propagano in linea retta se il mezzo è omogeneo; la loro intensità diminuisce inversamente al quadrato della distanza dalla sorgente puntiforme; producono fenomeni di interferenza e diffrazione; non sono deflessi dai campi magnetici. Si può pensare una tale onda (seguendo Maxwell) come un sistema di campi elettrici e magnetici che variano nel tempo e nello spazio, o (seguendo Einstein) come un fascio di fotoni, ciascuno in moto alla velocità della luce. Secondo Maxwell, l energia per unità di area trasportata dall onda è proporzionale a E 2, dove E rappresenta l ampiezza del vettore campo elettrico. Secondo Einstein, questo flusso di energia è proporzionale al numero medio di fotoni per unità di volume contenuto nel fascio, in cui ciascun fotone possiede un energia pari a hν. Si nota un legame tra la rappresentazione ondulatoria e quella corpuscolare della radiazione: la nozione, introdotta per la prima volta da Einstein, che il quadrato dell intensità del campo elettrico è una misura diretta della densità media dei fotoni (5) Composizione dello spettro I raggi X si generano quando gli elettroni emessi da un filamento incandescente vengono accelerati da una differenza di potenziale, colpiscono un bersaglio metallico e vengono frenati. 8

13 Spettro continuo Lo spettro dei raggi X ha una parte continua e una formata da due picchi incisivi, detta caratteristica. Si consideri un elettrone, dotato di energia cinetica K, che viene deviato dal nucleo di uno degli atomi che costituiscono il bersaglio di molibdeno. In una collisione simile viene trasferita quantità di moto all atomo da parte dell elettrone, che perde quindi energia. Dato che l atomo è molto più massiccio, la quantità di moto ceduta dall elettrone si traduce in un energia cinetica trascurabile per l atomo. L energia persa dall elettrone si manifesta sotto forma di un fotone X di energia hν, che viene irraggiato dal luogo d impatto. Questo processo viene chiamato radiazione di frenamento, talvolta indicata col corrispondente termine tedesco di bremsstrahlung, ed è responsabile dello spettro continuo dei raggi X. Si supponga che un fascio di elettroni venga accelerato da una differenza di potenziale V e incida su bersaglio spesso. Attraverso il processo di frenamento entro la struttura del bersaglio, gli elettroni possono perdere una qualunque quantità di energia da zero alla loro energia massima pari a Ve. Una caratteristica importante dello spettro continuo è il valore di soglia che si verifica in modo netto alla lunghezza d onda l min, al di sotto del quale viene a mancare del tutto l emissione radioattiva. Questo valore minimo di lunghezza d onda corrisponde a quell evento di collisione in cui un elettrone incidente (dotato inizialmente della massima energia Ve) perde interamente la sua energia in un singolo impatto, irraggiandola sotto forma di un solo fotone, in modo che: ev = hν max = hc/l min, ossia l min = hc/ev. L esistenza di una lunghezza d onda di soglia è un effetto quantistico. Si noti che, cambiando il materiale, per esempio rame al posto di molibdeno, la forma generale e l intensità dello spettro continuo possono mutare, ma la lunghezza d onda di soglia resta la stessa. Ciò è dovuto al fatto che questa particolare lunghezza d onda dipende solo dall energia cinetica degli elettroni che bombardano il bersaglio e non ha nulla a che fare con la sostanza di cui quest ultimo è costituito Spettro caratteristico Rivolgiamo ora la nostra attenzione ai due picchi, indicati con K a e K b. Questi picchi sono caratteristici del materiale di cui è costituito il bersaglio e, insieme con altri picchi che compaiono a lunghezze d onda maggiori, formano lo spettro X caratteristico dell elemento in questione. Vediamo come si creano questi fotoni X caratteristici: un elettrone incidente dotato di energia cinetica colpisce un atomo nel bersaglio che espelle un suo elettrone che risiede negli strati più profondi dell atomo. Se l elettrone espulso si trovava nello strato caratterizzato da n=1 (chiamato per ragioni storiche strato K), rimane un posto libero chiamato lacuna, nello strato K; uno degli elettroni più esterni si sposta per colmare questa lacuna e durante il processo l atomo emette un fotone X caratteristico. Se l elettrone di rimpiazzo proviene dallo strato L (n=2), genera la riga K a ; se invece proviene dallo strato immediatamente più esterno (chiamato M), dà luogo alla riga K b, e così via. Naturalmente queste transizioni lasciano una lacuna nello strato L o M, che verrà colmata da un elettrone ancora più esterno che così facendo provocherà l emissione di un altra riga caratteristica dello spettro. 9

14 La linea di base (E=0) rappresenta l energia dell atomo neutro di molibdeno nel suo stato fondamentale. Il livello indicato con K (E=20keV) si riferisce a quell energia dell atomo di molibdeno per il quale una lacuna è localizzata nello strato K. In modo simile, la linea L (E=2,7keV) è il livello di energia relativo ad una lacuna nello strato L, e via dicendo. Nella pratica, non importa quale configurazione atomica scegliamo per rappresentare il livello di base ad energia convenzionalmente nulla: ciò che è significativo fisicamente sono le differenze di energia tra i vari livelli, che sono sempre le stesse indipendentemente dalla scelta del livello E=0. La riga K a, ad esempio, si genera quando un elettrone dello strato L del molibdeno, saltando verso l alto nel diagramma dei livelli di energia, va a riempire una lacuna nello strato K. Ciò corrisponde ad affermare che una lacuna, muovendosi verso il basso nel diagramma, passa dallo strato K allo strato L (5) Interazione con la materia La capacità di penetrazione è modesta nel caso di fotoni di bassa energia (< 0,1 MeV, fotoni molli ); è elevata per fotoni di media e alta energia (>0,1 MeV, fotoni duri ). A differenza di particelle alfa ed elettroni, che hanno un percorso massimo oltre al quale non possono andare (range massimo), i fotoni non possono mai essere fermati del tutto, ovvero non esiste uno spessore di materiale, per quanto grande possa essere, per il quale si possa dire che ferma il 100% dei fotoni incidenti. Ciò per il seguente motivo: la legge di attenuazione dei fotoni in un mezzo attraversato è tale che per ogni incremento di materiale schermante si ottiene lo stesso fattore di riduzione. Per esempio, supponiamo di avere un fascio composto di 100 fotoni; attraversato un dato spessore di materiale, che chiamiamo X o, ne vengono eliminati il 10%. Rimangono così 90 fotoni, dopo un altro strato X o ne vengono rimossi ancora il 10% di quelli presenti ovvero il 10% di 90 cioè 9. Restano così 81 fotoni. Dopo un altro X o ne rimangono 72,9 e così via fino all infinito (attenuazione esponenziale). È chiaro quindi, che i fotoni non potranno mai essere eliminati del tutto, dovendosi sempre sottrarre la stessa percentuale di quelli presenti. È possibile però determinare uno strato di materiale che riduca i fotoni ad un numero talmente piccolo da non comportare danni all organismo umano. Ciò è quanto viene effettivamente fatto nel calcolo delle schermature delle sorgenti di radiazioni ionizzanti. Lo Strato EmiValente (SEV) di un fascio di fotoni è dato dallo spessore di materiale che riduce alla metà l intensità del fascio incidente (l intensità è il numero di fotoni che attraversa l unità di area (cm quadrato) nell unità di tempo (secondo). Si deve ricordare anche che qualsiasi radiazione monocromatica, una volta penetrata in un mezzo assorbente, dà luogo a radiazioni fotoniche diffuse, secondarie, di energia più bassa, a spettro continuo; dunque nel mezzo assorbente e quando emerge da esso si ritrova una radiazione policromatica, nel suo insieme meno dura della radiazione monocromatica incidente. I meccanismi principali di assorbimento dei raggi X da parte della materia sono l effetto fotoelettrico e l effetto Compton (si rimanda a testi specifici per l approfondimento dell argomento). Questi fenomeni fisici hanno avuto un ruolo decisivo nello sviluppo scientifico e hanno portato alla comprensione della natura delle onde elettromagnetiche poiché non potevano essere spiegati con le teorie della fisica classica (5). 10

15 3. MICROTOMOGRAFIA COMPUTERIZZATA TRIDIMENSIONALE A RAGGI X La microtomografia a raggi X (microct, micro Computerized Thomography) è una forma miniaturizzata di Tomografia Assiale Computerizzata (TAC) convenzionale. È una tecnica non distruttiva e fornisce le immagini tridimensionali (insieme di dati del volume) del coefficiente di attenuazione dei raggi X. Con la microct è quindi possibile ricostruire la struttura interna di un oggetto opaco senza che questo sia distrutto o preparato in alcun modo (non sono necessari tagli, coperture o trattamenti chimici del campione). Qualunque microscopio, ottico o elettronico, fornisce visualizzazioni di immagini 2D e, in generale, a partire da queste non è possibile fornire una ricostruzione 3D dell oggetto in esame. Solo con il sistema microct ciò è possibile (anche con un elevata risoluzione spaziale). Come lavora la microct? Una sorgente di raggi X illumina l oggetto in esame, che è posizionato su un supporto mobile. Il fascio incidente è collimato e molto sottile, in modo da illuminare una sezione stretta del campione. Il fascio incidente, a seguito dell interazione della materia, subirà un attenuazione della sua intensità. L intensità della radiazione che emerge dal campione viene rilevata tramite un detector di alta risoluzione. I dati raccolti vengono poi trasmessi ad un opportuno calcolatore. L oggetto viene poi ruotato a piccoli incrementi angolari per 180 e l operazione viene ripetuta per ogni piccola rotazione. Un programma del calcolatore analizza i dati registrati per produrre un immagine 2D dei coefficienti di assorbimento. L immagine 3D è ottenuta per sovrapposizione di immagini 2D di sezioni adiacenti. L uso di un rilevatore CCD (Charge Coupled Device) permette la realizzazione di immagini con una risoluzione dell ordine dei micron e limita al minimo il tempo di esame del campione (6) Caratteristiche della radiazione utilizzata La radiazione utilizzata (raggi X) è prodotta dal bombardamento di un materiale pesante con un fascio di elettroni (tubi a raggi X convenzionali). Essa è policromatica, ma viene opportunamente filtrata con filtro passa-banda per ottenere una radiazione monocromatica che attenua il problema di indurimento del fascio e migliora notevolmente la sensibilità della microct alle più piccole variazioni di assorbimento di raggi x all interno del campione (risoluzione di contrasto). L energia del fascio può essere sintonizzata sopra una vasta gamma permettendo che l assorbimento ottimale dei raggi X sia scelto per ogni campione secondo il formato e/o la sua composizione. Il fascio prodotto, inoltre, prima di incidere sul campione, deve essere opportunamente collimato in modo da consentire una scansione uniforme della sezione e un maggior numero di fotoni incidenti per unità di superficie Il rilevatore Il rilevatore utilizzato è costruito con la tecnologia CCD. È composto da tre parti: lo schermo al fosforo, che trasforma i raggi X in luce visibile; 11

16 un supporto di conduzione in fibra ottica, che conduce la radiazione visibile al CCD chip; il CCD chip, che rileva la radiazione luminosa e la trasforma in segnale elettrico. Come lavora un CCD rilevatore? Una volta che i raggi X colpiscono lo schermo al fosforo, essi vengono trasformati in radiazione luminosa. Quest ultima va quindi a colpire i fotodiodi presenti nel CCD chip. A questo punto i diodi diventano conduttori e la corrente che li attraversa va a scaricare dei condensatori direttamente collegati ad essi, caricati precedentemente, i quali avranno una tensione istantanea ai loro capi, minore di quella di partenza, inversamente proporzionale al flusso fotonico. In questo sistema ogni diodo rappresenta un pixel. Quando il periodo di integrazione del detector si è concluso, una serie di interruttori si chiudono e quindi la carica di ciascun condensatore viene trasferita ad un sistema di registrazione di questi dati che è composto da altri condensatori. In seguito, la carica presente sui condensatori di registro viene trasmessa ad un convertitore A/D che infine trasmette i dati al sistema di elaborazione. Dopo che questo trasferimento è avvenuto, gli interruttori vengono riaperti e i condensatori attaccati ai fotodiodi vengono ricaricati. A questo punto un nuovo periodo di integrazione può avvenire. Caratteristiche di questo tipo di rilevatore sono: capacità di rilevare radiazioni incidenti anche per esposizioni prolungate senza problemi di non linearità e di saturazione termica; basso rumore. Ciò permette di generare immagini 3D con un alto rapporto segnale/rumore (SNR) e con una elevata risoluzione spaziale (7) Ricostruzione di un immagine tomografica In tomografia computerizzata l immagine è costruita con un procedimento peculiare basato sulla Trasformata di Radon modificata. I passi sono qui di seguito sintetizzati: si misura l attenuazione di un fascio di raggi X in un numero elevato di traiettorie parallele attraverso lo strato corporeo in studio; si determina la componente di attenuazione avvenuta nei singoli voxel (volume corporeo elementare) attraverso un algoritmo specifico di ricostruzione di immagini tomografiche (Retroproiezione); si realizza infine un display visivo su monitor dei valori numerici ricostruiti. Si ricordi inoltre che l immagine tomografica computerizzata è un immagine digitale la cui unità costitutiva è il pixel (all aumentare della densità elettronica il pixel corrispondente al voxel avrà una gradazione di grigio via via sempre più chiara) (8) Immagini digitali: caratteristiche, acquisizione, qualità, elaborazione La parola digitale deriva dal vocabolo inglese digit che vuol dire cifra, numero, perciò immagine digitale significa letteralmente immagine numerica. Se prendiamo in considerazione le immagini radiografiche, dette anche immagini analogiche, sappiamo che esse sono formate da un insieme di granuli di sali di argento che, 12

17 ossidati dall esposizione alle radiazioni X, precipitano durante il trattamento e assumono colore nero. Questi granuli, distribuendosi in maggiore o minore concentrazione sul supporto trasparente della pellicola, determinano nei diversi punti le differenti tonalità di grigio caratteristiche di questo tipo di immagine. L immagine digitale, invece, non è formata da granuli di sali di argento ma da tanti, piccolissimi quadratini, denominati pixel (da picture elements = elementi dell immagine). Ciascun quadratino presenta nel suo interno un unica tonalità di grigio, tale tonalità varia per i diversi pixel a seconda dei punti dell immagine. Tutti i pixel uniti assieme formano una matrice bidimensionale o tridimensionale che da origine all immagine finale. Ad ogni pixel viene assegnato un numero, il cui valore assoluto corrisponde ad una determinata tonalità nella scala dei grigi. Maggiore sarà il valore di questo numero, più il pixel tenderà al bianco su di un monitor televisivo e viceversa, per valori numerici che si avvicineranno allo zero, la tonalità acquisita dal pixel tenderà al nero. Per le immagini a colori il tipo di discorso è simile, anche se in questo caso i diversi pixel assumeranno una differente gradazione dei tre colori principali: rosso, verde e blu. Queste gradazioni, sommandosi tra loro, produrranno una differente tonalità di colore finale per ogni pixel. L insieme bidimensionale o tridimensionale di tutti i pixel formerà l immagine digitale a colori Caratteristiche L immagine digitale altro non è che una matrice di numeri e, come tale, rispetto ad una immagine radiografica, che viene chiamata anche immagine analogica, presenta l enorme vantaggio di poter essere utilizzata da un calcolatore elettronico che può visualizzarla su di un monitor, memorizzarla nel suo archivio elettronico, inviarla a distanza ad un altro calcolatore utilizzando un semplice collegamento telefonico, condividerla con altri computer per attività di teleconsulto. A differenza delle immagini analogiche, che possono essere esaminate solo sul supporto e nel formato in cui vengono prodotte, le immagini digitali esistono in forma elettronica e pertanto possono essere visualizzate in qualunque formato e su qualunque tipo di supporto: monitor del computer, pellicola o carta. Le immagini digitali possono essere archiviate insieme con i relativi referti, per poi essere richiamate in qualunque momento. Ma la caratteristica più importante delle immagini digitali è, senza dubbio, la possibilità di modificarne le caratteristiche a seconda delle necessità per mezzo di algoritmi di elaborazione. Tali algoritmi, costruiti per esaltare alcune componenti di una immagine, possono migliorare notevolmente le capacità di visualizzazione dell occhio umano e consentire l identificazione di particolari che altrimenti potrebbero essere persi Acquisizione Le immagini digitali possono essere prodotte direttamente o indirettamente. La produzione diretta avviene quando l immagine viene acquisita già in formato digitale, come nel caso della TAC. Nella produzione indiretta, invece, l immagine viene acquisita prima in forma analogica e poi trasformata in formato digitale (conversione analogico-digitale). 13

18 Nella conversione analogico-digitale va sempre tenuta ben presente l accuratezza della trasformazione, perché questa conversione si accompagna sempre ad una perdita di una parte di informazioni. Prendendo nuovamente in considerazione la nostra immagine radiografica su pellicola, le tonalità di grigio in essa presenti sono innumerevoli, anche se l occhio umano non riesce a percepirne più di differenti, ma per trasformarla in un immagine digitale dovremmo ridurre queste molteplici tonalità ad un numero più contenuto di esse. Si dovrà perciò definire una scala con 1000 o 2000 differenti gradazioni di grigio e assegnare poi a ciascun pixel, in cui viene suddivisa l immagine, un determinato valore di questa scala. Nella trasformazione di un immagine in formato digitale si realizza la perdita di informazioni precedentemente segnalata. Ciò si verifica su due piani differenti: il primo riguarda la compressione di una scala formata da moltissimi valori di grigio che viene ridotta a soli 1000 o 2000 valori differenti, il secondo è in relazione con le dimensioni dei pixel che utilizziamo per trasformare la nostra immagine che, per quanto piccoli, non saranno mai paragonabili a un punto geometrico (in genere maggiore di 2 µm). Quindi, per stabilire l entità di questa perdita di informazioni, dobbiamo prendere in considerazione i due più importanti parametri che caratterizzano un immagine digitale: la risoluzione spaziale, definita dal numero di pixel che formano la matrice dell immagine, e il range dinamico, determinato dal numero di valori di grigio presenti nell immagine. Se volessimo ottenere un immagine digitale con la stessa risoluzione spaziale di quella analogica, un radiogramma di formato 35 x 43 cm dovrebbe essere scomposto in una matrice di x pixel. Tali dimensioni appaiono spropositate soprattutto in considerazione dello spazio di memoria necessario per archiviare tale immagine (37,6 Gbytes) e del fatto che l attuale tecnologia dispone di monitors per la visualizzazione con risoluzione massima di circa 2000 x 2000 punti. È perciò necessario ridurre la matrice a valori più accettabili e con essa si ridurrà necessariamente la risoluzione spaziale in conseguenza dell aumento delle dimensioni dei pixel. Se però consideriamo che in condizioni ottimali, elevata frequenza e massimo contrasto, la risoluzione spaziale dell occhio umano non si spinge al di sotto di 0,1 mm, allora i valori della matrice, sempre per una immagine di formato 35 x 43 cm, possono scendere a 4096 x 5032 pixel, ampiamente compatibili con gli spazi e i costi delle memorie di massa attuali Qualità e rapporto segnale/rumore La qualità di un immagine rappresenta uno dei fattori più importanti nella pratica della analisi per immagini. Ciò è facilmente comprensibile per il fatto che immagini di scarsa qualità non consentono la visualizzazione di eventuali alterazioni presenti. Al contrario, evidenziano irregolarità che possono essere erroneamente interpretate. Esistono dei parametri oggettivi che governano il contenuto informativo delle immagini digitali determinando quindi la possibilità di individuare la loro qualità. Tali parametri sono simili a quelli che consideriamo per le immagini analogiche, anche se nelle immagini digitali assumono maggiore importanza perché i sistemi elettronici sono molto più sensibili al degrado delle immagini di quanto non lo sia l occhio umano. Inoltre, esistono dei fattori aggiuntivi che intervengono provocando un generale peggioramento della qualità dell immagine. Tali fattori agiscono in modo del tutto casuale e possono essere solo parzialmente controllati, per ridurre i loro effetti, ma mai eliminati completamente. Essi intervengono producendo rumore, cioè inducendo un degrado o una perdita di una parte delle informazioni contenute nell immagine. Il rumore è quindi una componente intrinseca, anche se indesiderata, dei processi di acquisizione e trattamento delle immagini, sia di quelle analogiche che di quelle digitali, ma 14

19 riveste un ruolo sicuramente più importante nelle apparecchiature digitali dove i sistemi elettronici sono particolarmente gravati da alcuni tipi specifici di rumore. I fattori più importanti che determinano le caratteristiche qualitative di una immagine digitale sono rappresentati dalla risoluzione spaziale e da quella di contrasto. Della risoluzione spaziale si è già accennato in un precedente paragrafo. La risoluzione di contrasto fa riferimento alla capacità di differenziare strutture vicine mediante tonalità diverse di una scala di grigi. Tali differenze sono relative all assorbimento di fotoni X per la tomografia computerizzata. Il contrasto di una immagine, quindi, è ciò che ci consente di percepire le informazioni contenute nell immagine stessa, ma, come si può ben comprendere se prendiamo ad esempio le immagini TC, non è solo importante un elevata risoluzione di contrasto, per registrare anche le più piccole differenze esistenti tra strutture vicine, bensì risulta necessario avere la possibilità di modificare il contrasto in modo selettivo all interno dell immagine. Un altra possibilità largamente sfruttata consiste nello studio dell immagine TC tramite una finestra sovrapposta alla scala dei grigi: i livelli che cadono all interno della finestra attiva sono visualizzati creando il massimo contrasto tra loro mentre gli altri sono saturati ai valori più alti e più bassi della scala, cioè assumono tonalità di bianco o di nero. Questo procedimento è estremamente utile per studiare, sulla stessa immagine, fasi del campione che mostrano caratteristiche di interazione con le radiazioni elettromagnetiche nettamente differenti. La risoluzione di contrasto viene espressa dal numero di livelli di grigio distinguibili nell immagine. Nei sistemi digitali questo numero è pari a 2 elevato al numero di bit che codificano per ciascun pixel. Si passa perciò dai livelli di grigio percepibili in una immagine analogica ad almeno 256 livelli di un sistema ad 8 bit, che attraverso la regolazione della finestra consente una utilizzazione ottimale delle informazioni contenute nell immagine. Altri parametri ben codificati, da cui dipende la qualità d immagine, sono l uniformità spaziale e la linearità. L uniformità spaziale rappresenta l attribuzione di uno stesso valore numerico a tutti i pixel relativi ad un area omogenea e costante. La valutazione di questo aspetto riveste notevole significato nell esecuzione dei controlli periodici sui sistemi elettronici e nella messa a punto di campioni di calibrazione. Concettualmente collegata alla uniformità spaziale è la linearità. Con essa si esprime il rapporto di diretta proporzionalità esistente tra la densità di un punto dell oggetto di riferimento e il valore registrato per il pixel corrispondente. Si è più volte accennato all esistenza di una entità di disturbo, il rumore, che agisce in senso negativo nei confronti della qualità delle immagini. Esso è il risultato di diversi fattori che, seppur con meccanismi diversi, agiscono degradando le caratteristiche delle immagini. Tale azione può talvolta raggiungere livelli tali da rendere le immagini prive di significatività. Infatti, se due strutture di diversa opacità presentano differenze di assorbimento minori od uguali al rumore del sistema, esse saranno tra loro indistinguibili. Pertanto la valutazione del rumore di un sistema elettronico assume particolare rilievo; ma un significato assai maggiore riveste la misura dell effetto del rumore nel processo di formazione delle immagini. Il rapporto segnale/rumore esprime una valutazione oggettiva di questa interferenza ed è sicuramente un elemento importante per un giudizio accurato della qualità di un sistema digitale. Come già espresso in precedenza, ricordiamo che il rumore è una componente inscindibile del segnale e pertanto anche l analisi più accurata delle fonti di rumore ci potrà consentire solo 15

20 di incrementare il valore del rapporto segnale/rumore senza però poter mai eliminare la presenza di questa sgradita componente. Il segnale sarà perciò associato a una componente spuria rappresentata dal rumore. Per ridurre l effetto del rumore possiamo misurare più volte il segnale elettrico e rappresentare su di un grafico la media di queste misure. Dato che il segnale assume sempre valore positivo, mentre il rumore oscilla in modo del tutto casuale, il risultato tenderà a ridurre gli effetti del rumore, aumentando il rapporto segnale/rumore. Le principali fonti di rumore sono rappresentate dal rumore quantico, dal rumore elettronico, dal rumore del convertitore analogico-digitale e dal rumore indotto dai processi di elaborazione. Il rumore quantico è comune sia ai sistemi analogici che a quelli digitali poiché dipende dal meccanismo stesso di produzione dei raggi X a livello del tubo radiogeno e dalla interazione di questi con la materia. Un fascio di raggi X può essere considerato come formato da tanti piccoli elementi corpuscolati, i fotoni, ciascuno contenente una determinata quantità di energia. La generazione di questi fotoni come pure la loro interazione con la materia non avviene in modo uniforme. Se consideriamo una sezione del fascio e rileviamo il numero di fotoni per unità di superficie, questi saranno estremamente variabili a seconda del punto preso in esame. Ciò si spiega considerando che l emissione dei raggi X è un evento casuale governato da leggi probabilistiche. In base a tali conoscenze, l entità della fluttuazione del numero di fotoni per unità di superficie è pari alla radice quadrata del valore medio calcolato. Per esempio, se un fascio contiene una media di 100 fotoni per mm 2, il numero di fotoni può variare tra con un valore percentuale delle oscillazioni pari al 10% (10/100). Si dimostra facilmente che all aumentare dell esposizione, e quindi della concentrazione di fotoni per unità di superficie, l effetto del rumore quantico si riduce. Infatti lavorando con fotoni per mm 2, la fluttuazione è dell ordine di con un valore percentuale pari all 1% (100/10.000). Il rumore elettronico è una espressione generica utilizzata per indicare tutte le diverse fonti di disturbo legate all imperfezione dei vari componenti di un sistema elettronico. Il rumore elettronico può essere contenuto il più possibile utilizzando componenti di elevata qualità e schermatura totale dei cavi, ma anche apparecchiature altamente affidabili presentano un certo grado di rumorosità. Il rumore del convertitore analogico-digitale è esclusivo dei sistemi digitali. Questa apparecchiatura trasforma una grandezza analogica in dati digitali, campionando un segnale continuo e rappresentando i valori delle campionature sotto forma di valori interi finiti. Pertanto, oltre al rumore elettronico, va preso in considerazione anche l errore implicito nel processo di conversione che dipende direttamente dal numero di bit che codificano per ciascun pixel e dall ampiezza del range dinamico. Questo tipo di rumore, che spesso viene indicato con il nome di rumore di quantizzazione, può essere contenuto a livelli praticamente trascurabili digitalizzando le immagini a 12 bit (4096 livelli). Anche nella conversione digitale-analogica, che interviene nel processo di trasformazione dei dati numerici in segnale elettrico da inviare al monitor televisivo, verrà introdotto un rumore che normalmente presenta un entità trascurabile. Il rumore legato ai processi di elaborazione si genera durante il trattamento dei dati. Infatti, qualunque procedimento di elaborazione numerica delle immagini, anche se conduce ad una migliore percezione di una parte delle informazioni in esse contenute, altera i dati originali e, quindi, introduce una certa quota di rumore. 16