Mitocondri 06/12/2012. Biotecnologie_2012. Teoria endosimbiontica.

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1 Mitocondri Biotecnologie_ Teoria endosimbiontica cells/organelles/ 1

2 Conversione di energia (1) *l ambiente in assoluto più ossigenato, se sangue arterioso * Mediante una serie di reazioni che si svolgono nel citosol, l energia derivata dalla parziale ossidazione delle moleole di carboidrati ricche di energia è utilizzata per formare ATP, la moneta energetica delle cellule. Un modo molto più efficace di generazione di energia è comparso molto precocemente nell evoluzione. E basato sulle membrane, e permette alle cellule di acquisire energia da una gran varietà di sorgenti. Es: Conversione di energia luminosa in energia chimica nella fotosintesi Respirazione aerobica che permette di utilizzare l ossigeno per produrre grandi quantità di ATP a partire delle molecole di cibo. Hematology s/1971/jns issue 3/jns /production/images/small/jns_1971_35_3_0263.fig00 7.gif Conversione di energia (2) La membrana che viene utilizzata per produrre ATP nei procarioti è la membrana plasmatica. Negli eucarioti, la membrana plasmatica è riservata per altri processi di trasporto. Vice versa, delle membrane specializzate all interno di organelli in grado di convertire energia, sono utlizzate per produrre ATP: Mitocondri, presenti nelle cellule di praticamente tutti gli organismi eucarioti (funghi, animali, piante) Plastidi, sopratutto cloroplasti, che si trovano nelle piante. Nelle foto al microscopio elettronico, l aspetto morfologico più appariscente dei mitocondri e cloroplasti è la grande quantità di membrane interne che essi contengono. Le membrane interne forniscono l impalcatura per un eleborato insieme di processi di trasporto di elettroni che produce la maggior parte dell ATP delle cellule. Accoppiamento chemiosmotico (1) Meccanismo commune usato dai mitocondri, cloroplasti e procarioti per ricavare energia a scopi energetici. Il termine riflette un collegamento tra le reazioni per formare legami chimici che generano l ATP ( chemi ) e i trasporti di membrana ( osmotico ). Accoppiamento chemiosmotico (2) Il processo di accoppiamento ha luogo in due passi collegati, che si svolgono entrambi mediante complessi proteici inseriti in una membrana. Passo 1: Elettroni ad elevata energia (derivati dall ossidazione di molecole di cibo, dall azione della radiazione solare o da altre sorgenti) sono trasferiti lungo una serie di trasportatori di elettroni inseriti nella membrana. Questi trasferimenti di elettroni rilasciano energia che è utilizzata per pompare protoni (H + ) che è ubiquitaria nelle cellule) attraverso le membrane e quindi per generare un gradiente protonico elettrochimico. [Un gradiente ionico attraverso una membrana è una forma di energia immagazzinata, che può essere utilizzata per svolgere lavoro utilie quando gli ioni hanno la possibilità di rifluire attraverso la membrana lungo il loro gradiente elettrochimico. Passo 2: I protoni H + fluiscono in dietro lungo il loro gradiente elettrochimico lungo una macchina proteica chiamata ATP sintasi, che catalizza la sintesi energia dipendente dell ATP a partire dall ADP e fosfato inorganico (P i ). Questo enzima ubiquitario gioca il ruolo di una turbina, permettendo che il gradiente protonico porti alla produzione di ATP. Produzione di energia nei mitocondri 2

3 Membrane mitocondriali I mitocondri sono circondati da due membrane, la membrana mitocondriale esterna e la membrana mitocondriale interna. La membrana mitocondriale esterna racchiude completamente il mitocondrio e rappresenta il confine con il citosol. La membrana mitocondriale interna contiene due domini interconnessi: Membrana delimitante interna: sotto la membrana mitocondriale esterna. Particolarmente ricca di proteine implicate nell importo di proteine mitocondriali. Creste mitocondriali: si estendono verso l interno dell organello. La membrana delimitante interna e le creste sono collegate da sottili connessioni giunzioni delle creste. Adattato da Karp G.: Biologia Cellulare e Molecolare: Concetti ed Esperimenti, EdiSES, IV ed., 2010; Smith & Wood, Cell Biology,2nd ed., Stanley Thornes, Membrana mitocondriale esterna E formata per il circa 50% di lipidi (lipidi simili a qulli della maggior parte delle altre membrane delle cellule eucariotiche. Contiene solo il circa 5% della massa totale di proteine dei mitocondri. Le proteine più abbondanti sono le porine, proteine integrali che formano ampi canali (2 3 nm) circondati da una palizzata di foglietti β (similmente alla membrana esterna che fa parte della parete cellulare dei batteri Gram ). Le porine sono strutture dinamiche in grado di chiudersi reversibilmente a seconda delle condizioni della cellula: Quando i canali delle porine sono aperti, la membrana esterna è permeabile a molecole con peso molecolare fino a 1000 o meno, in particolare anche l ATP, il NAD e il coenzima A, che giocano un ruolo chiave nel metabolismo energetico. Contiene diversi enzimi quali la NADH /citocromo b5 ossido reduttasi, la monoamina ossidasi e enzimi coinvolti nell ossidazione dell adrenalina, nella degradazione del triptofano e l allungamento degli acidi grassi. Porine Presenti sia nella membrana esterna dei batteri Gram che nella membrana esterna dei mitocondri /porin_page.htm Membrana mitocondriale interna (1) Praticamente priva di colesterolo ma ricca di un lipide inusuale il difosfatidil glicerolo, detto anche cardiolipina. La cardiolipina, che ha una bassa concentrazione nella membrana mitocondriale esterna, conta per circa il 20% del contenuto totale di lipidi della membrana interna. La membrana interna contiene più di 100 diversi tipi di polipeptidi Contiene un alto rapporto proteine/lipidi (> 3:1 in peso; circa il 20% del contenuto totale di proteine dei mitocondri) Cardiolipina (1) La cardiolipina (difosfatidilglicerolo) è un lipide molto concentrato della membrana mitocondriale interna, ma anche nella membrana plasmatica dei batteri, ossia in membrane coinvolte nella trasduzione di energia. Cardiolipina (2) La cardiolipina è importante per ridurre la permeabilità ai protoni dando così origine al gradiente elettrochimico di protoni fra lo spazio intermembranario e la matrice dei mitocondri. La cardiolipina è un doppio fosfolipide inusuale, che contiene quattro catene di acidi grassi e che si trova principalmente nella membrana mitocondriale interna

4 Cardiolipina (3) Membrana mitocondriale interna (2) Nel cuore, tessuto ricco di mitocondri, i fosfolipidi mitocondriali svolgono diversi ruoli nella regolazione dei vari processi mitocondriali che includono l apoptosi, il trasporto degli elettroni e l importazione verso i mitocondri di proteine e lipidi. (Hatch GM. Cell biology of cardiac mitochondrial phospholipids. Biochem Cell Biol. 82: , 2004). E la membrana specializzata per la trasduzione di energia ed è impermeabile a quasi tutti i piccoli ioni. Vi si trovano tre tipi principali di complessi proteici: Componenti della catena di trasporto di elettroni (catena respiratoria): complessi I, II, II e IV. L ATP sintasi Proteine di trasporto specifiche che mediano il trasporto di metaboliti verso e al di fuori della matrice mitocondriale. L architettura e la grande fluidità della membrana mitocondriale interna facilitano le interazioni tra i componenti richiesta per la produzione di ATP e in particolare la diffusione laterale di piccole proteine coinvolte nel trasporto di elettroni della catena di trasporto degli elettroni. Le membrane mitocondriali dividono i mitocondri in due compartimenti ripieni di fluido: Matrice: Consistenza di gel, dovuta ad elevata concentrazione di proteine idrosolubili (< 500 mg/ml). Contiene diversi enzimi, in particolare quelli che catalizzano i vari passi del ciclo degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs) Contiene ribosomi e parecchie molecole di DNA a doppio filamento, di solito circolari. Il DNA mitocondriale codifica per un piccolo n di proteine (circa 13 nell uomo) coinvolte nel trasporto degli elettroni nelle creste mitocondriali, per due RNA ribosomiali e per una ventina di trna. Spazio intermembrane Proteine coinvolte nella morte cellulare programmata (apoptosi). MATRICE & MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA Reazioni che catalizzano l ossidazione del piruvato e degli acidi grassi a CO 2 e H 2 O. Sintesi ad esse accoppiata di ATP a partire da ADP + P i. 4

5 Mitocondri DNA MITOCONDRIALE DNA mitocondriale (1) DNA mitocondriale (2) Mappa del DNA mitocondriale umano (mtdna) che illustra i loci dove possono avere luogo mutazioni che portano a citopatie. Le lettere singole sono le abbreviazioni convenzionali ad una lettera degli aminoacidi. ND: NADH deidrogenasi CO: citocromo ossidasi 12S e 16S: RNAs ribosomali /figure/A3442/?report=objectonly La catena respiratoria mitocondriale. Le subunità codificate dal DNAnucleare sono in rosso, mentre le subunità codificate dal mtdna sono in porpora. I protoni (H + ) sono pompati dalla matrice verso lo spazio intermembranoso attraverso i complessi I, III e IV. Essi ritornano verso la matrice attraverso il complesso V (ATP sintasi) con la concomitante produzione di ATP. Il citocromo c (Cyt c) è una proteina di trasferimento di elettroni codificata dal DNA nucleare. ND: NADH deidrogenasi SDH: succinato deidrogenasi COX: citocromo ossidasi A6 e A8: subunità del complesso V dell ATP sintasi BK22005/figure/A3436/ Fissione e fusione dei mitocondri Tre gruppi di reazioni in regioni distinte dei mitocondri (1) MATRICE (insieme a proteine della membrana mitocondriale interna rivolte verso la matrice): Ossidazione del piruvato e degli acidi grassi a CO 2 Riduzione dei coenzimi NAD + e FAD a NADH e FADH 2 5

6 Tre gruppi di reazioni in regioni distinte dei mitocondri (2) MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA: Trasporto di elettroni dal NADH e dal FADH 2 all O 2 Accoppiato alla creazione di FORZA PROTON MOTRICE (gradiente protonico) attraverso la membrana mitocondriale interna. COMPLESSO F 0 F 1 SULLA MEMBRANA INTERNA: Utilizzazione dell energia accumulata nel gradiente protonico per la sintesi dell ATP. Mitocondri IMPORTAZIONE DELLE PROTEINE NELLA MATRICE Import of proteins into mitochondria Proteins are targeted for mitochondria by an amino terminal presequence containing positively charged amino acids. Proteins are maintained in a partially unfolded state by association with a cytosolic Hsp70 and are recognized by a receptor on the surface of mitochondria. The unfolded polypeptide chains are then translocated through the Tom complex in the outer membrane and transferred to the Tim complex in the inner membrane. The voltage component of the electrochemical gradient is required for translocation across the inner membrane. The presequence is cleaved by a matrix protease, and a mitochondrial Hsp70 binds the polypeptide chain as it crosses the inner membrane, driving further protein translocation. A mitochondrial Hsp60 then facilitates folding of the imported polypeptide within the matrix. Mitocondri METABOLISMO e/a1633/ 6

7 MOVIMENTO DEL PIRUVATO DAL CITOSOL VERSO LA MATRICE MITOCONDRIALE (1) In condizioni aerobiche il piruvato è trasportato all interno dei mitocondri in scambio con l ione OH mediante il trasportatore per il piruvato («pyruvate carrier»), un antiporto. Metabolismo nei mitocondri (1) DECARBOSSILAZIONE DEL PIRUVATO MOVIMENTO DEL PIRUVATO DAL CITOSOL VERSO LA MATRICE MITOCONDRIALE (2) Il complesso della piruvato deidrogenasi Le molecole di piruvato prodotte nella glicolisi sono trasportate attraverso la membrana mitocondriale interna verso la matrice, dove vengono decarbossilate per formare gruppi acetile, con 2 atomi di carbono ( CH 3 COO 2 ). Il gruppo acetile forma in seguito un complesso con il coenzima A per formare acetil CoA: Piruvato + HS CoA + NAD + acetil CoA + CO 2 + NADH + H + La decarbossilazione del piruvato ed il trasferimento del gruppo acetile al CoA sono catalizzati dal complesso multienzimatico gigante della piruvato deidrogenasi nella matrice mitocondriale. La struttura dell importante molecola trasportatrice ( Carrier ) attivata acetil CoA. In alto un modello space-filling della struttura. Un atomo di zolfo (giallo) forma un legame tioestere con l acetato. Dato che questo è un legame ad elevata energia, che rilascia una grande quantità di energia libera quando è idrolizzato, la molecola di acetato può essere prontamente trasferita ad altre molecole. 7

8 Decarbossilazione ossidativa del piruvato (matrice mitocondriale) Decarbossilazione del piruvato: collegamento tra la glicolisi e il ciclo di Krebs Il piruvato viene convertito in CO 2 (decarbossilato) e in acetilcoa, in un processo che produce anche una molecola di NADH. Il coenzima A (CoA SH) é un trasportatore generale di gruppi acilici attivati in una grande varietà di reazioni. Nella decarbossilazione irreversibile del piruvato viene rilasciato CO 2 e sono catturati dal NAD elettroni ad alto potenziale di trasferimento. La reazione della piruvato deidrogenasi ha molti aspetti in comune con il ciclo di Krebs stesso. I prodotti significativi del ciclo di Krebs Consegna elettroni alla catena respiratoria sulla m.m. interna Diffonde via dalla cellula Ciclo di Krebs, degli acidi tricarbossilici o dell acido citrico Consegna elettroni alla catena respiratoria sulla m.m. interna Il ciclo dell acido citrico in cui gruppi acetilici trasferiti dal acetil CoA sono ossidati a CO 2 6/?report=objectonly 8

9 Appunti sull ossidazione del succinato Il succinato è ossidato a fumarato dalla succinato deidrogenasi. L accettore di idrogeno è il FAD invece che il NAD + che viene usato nelle altre tre reazioni di oasido reduzione del ciclo. Nella succinato deidrogenasi l anello isoalloxazinico del FAD è legato covalentemente alla catena laterale di un istidina dell enzima (E FAD) Il FAD è l accettore dell idrogeno in questa reazione in quanto lle modificazioni di energia libera sono insufficienti per ridurre il NAD+. Il FAD è quasi sempre l accettore di elettroni nelle ossidazioni che rimuovono due atomi di idrogeno da un substrato. Appunti sulla succinato deidrogenasi E una proteina che contiene tre differenti tipi di centri ferro zolfo (Fe S). Diversamente dagli altri enzimi del ciclo dell acido citrico in quanto è inserita nella membrana mitocondriale interna. Di fatto, è associata direttamente alla catena di trasporto degli elettroni, il collegamento tra il ciclo dell acido citrico e la formazione di ATP. IL FADH 2 formato dall ossidazione del succinato non si dissocia dall enzima, al contrario del NADH prodotto in altre reazioni di ossido riduzione. Invece, due elettroni sono trasferito dal FADH 2 direttamente ai centri Fe S dell enzima. L accettore finale di questi elettroni sarà l ossigeno molecolare. Stechiometria del ciclo dell acido citrico Riassunto delle reazioni (1) 1. Due atomi di carbono entrano nel ciclo nel processo di condensazione di un unità acetile (dall acetil CoA) con l ossaloacetato. Due atomi di carbono escono dal ciclo sotto forma di CO 2 nelle decarbossilazioni successive, catalizzate dalla isocitrato deidrogenasi e α chetoglutarato deidrogenasi. Dati con marcatura isotopica rivelano che gli atomi di carbono che entrano in ogni ciclo non sono quelli che lo abbandonano. 9

10 Riassunto delle reazioni (2) 2. Quatro paia di atomi di idrogeno lasciano il ciclo in quattro reazioni di ossidazione. Due molecole di NAD + sono ridotte nella decarbossilazione ossidativa dell isocitrato e del α chetoglutarato, una molecola di FAD è ridotta nell ossidazione del succinato e una molecola di NAD + è ridotta nell ossidazione del malato. 3. Un composto ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato, di solito il GTP, viene generato nella scissione di un legame tioestere del succinil CoA. Riassunto delle reazioni (3) 4. Sono consumate due molecole di acqua: una nella sintesi del citrato mediante l idrolisi dell citril CoA e l altra nell idratazione del fumarato. L efficacia del ciclo dell acido citrico può essere aumentata dalla disposizione degli enzimi costituenti. Ci sono sempre più prove sperimentali che gli enzimi siano associati fisicamente uno all altro per facilitare l incanlamento deel substrato fra i siti attivi. E sto suggerito il nome di METABOLONE per definire tali complessi multienzimatici. Ruolo dell ossigeno nel ciclo dell acido citrico L ossigeno molecolare non partecipa direttamente al ciclo dell acido citrico. Tuttavia, il ciclo opera soltanto in condizioni aerobiche perchè il NAD + e il FAD possono venire rigenerati nei mitocondri soltanto mediante il trasferimento di elettroni all ossigeno molecolare. Mentre la glicolisi può svolgersi sia in modo aerobico che anerobico, il ciclo dell acido citrico è strettamente aerobico. Il ciclo dell acido citrico genera elettroni ad alta energia Il ciclo dell acido citrico converte gli atomi di carbonio dell acetil CoA in CO 2 che la cellula elimina come prodotto di scarto. Il punto molto importante è che tale l ossidazione genera elettroni ad alta energia, trasportati dalle molecole «carrier» attivate, NADH e FADH 2. Questi elettroni ad alta energia sono in seguito trasferiti alla membrana mitondriale interna dove incontrano la catena di trasporto degli elettroni. La perdita degli elettroni dal NADH e dal FADH 2 rigenera il NAD + e il FAD, necessari per che il metabolismo ossidativo prossegua. Metabolisamo CATENA DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 10

11 La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (1) La reazione energeticamente favorevole H 2 + ½ O 2 H 2 0 viene fatta svolgere in diversi passi in modo che l energia rilasciata possa essere immagazzinata invece di venire persa nell ambiente sotto forma di calore. Prima gli atomi di idrogeno sono separati in protoni ed elettroni. Gli elettroni passano attraverso una serie di trasportatori di elettroni presenti sulla membrana mitocondriale interna. In diverse occasioni i protoni e gli elettroni sono ricombinati transitoriamente. I protoni ritornano permanentemente alla matrice soltanto alla fine della catena di trasporto degli elettroni; nella matrice possono essere usati per neutralizzare le cariche negative create dall aggiunta finale di elettroni alla molecola di ossigeno. La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (2) Il processo di trasporto degli elettroni inizia quando l ione idruro (ione carico negativamente dell idrogeno: H ) è rimosso dal NADH (per rigenerare NAD + ) ed è convertito in un protone e due elettroni (H H + + 2e ). I due elettroni sono passati al primo di una serie di più di 15 diversi trasportatori di elettroni nella catena respiratoria. Gli elettroni iniziano con energia molto elevata e progressivamente la perdono mentre passano lungo la catena. Nella maggior parte dei passi gli elettroni passano da un ione metallico ad un altro (ciascuno di questi ioni è strettmanete legato ad una molecola proteica che altera l affinità verso gli elettroni del metallo) La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (3) La maggior parte delle proteine coinvolte sono raggruppate in tre grandi complessi enzimatici respiratori, ciascuno dei quali contiene proteine transmembrana che trattengono i complessi fermamamente nella membrana mitocondriale interna. Ogni complesso della catena ha un affinità verso gli elettroni superiore a quella del suo predecessore, e quindi gli elettroni passano in sequenza da un complesso all altro finchè non sono trasferiti all ossigeno, che ha l affinità per gli elettroni superiore a tutti gli altri. Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (1) La fosforilazione ossidativa è possibile dato che i trasportatori di elettroni sono strettamente associati alle molecole proteiche. Le proteine guidano gli elettroni lungo la catena respiratoria in modo che essi si muovano in sequenza da un complesso enzimatico al successivo. Il trasferimento degli elettroni è accoppiato: alla captazione e rilascio orientati di H + a modificazioni allosteriche nelle pompe protoniche coinvolte nella conversione di energia. Il risultato complessivo è il pompaggio di H + attraverso la membrana interna dalla matrice allo spazio intermembrane pilotato dal flusso energeticamente favorevole di elettroni. Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (3) Il movimento dell H + ha due conseguenze principali: Genera un gradiente di ph attraverso la membrana interna, con ph superiore nella matrice rispetto allo spazio intermembrana (e al citosol, dato che la membrana esterna è permeabile ). Genera un gradiente di voltaggio (potenziale di membrana) attraverso la membrana interna, in cui l interno è negativo e l esterno positivo (come risultato del flusso netto di ioni positivi). 11

12 Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (4) Il gradiente di ph (ΔpH) pilota il ritorno degli H + verso la matrice, così rinforzando l effetto del potenziale di membrana (ΔV), che agisce per attrarre qualsiasi ione positivo verso la matrice e quindi per spingere gli ioni negativi fuori. Complessivamente, il ΔpH e il ΔV costituiscono un gradiente elettrochimico protonico. Il gradiente elettrochimico protonico esercita una forza proton motrice (misurata in millivolts, mv) La catena respiratoria consiste di quattro complessi: tre pompe protoniche e un collegamento fisico con il ciclo dell acido citrico (1) Gli elettroni sono trasferiti dal NADH all O 2 mediante una catena di tre grandi complessi proteici chiamati NADH Q ossidoreduttasi, Q citocromo C ossido reduttasi e citocromo C ossidasi. La catena respiratoria consiste di quattro complessi: tre pompe protoniche e un collegamento fisico con il ciclo dell acido citrico (1) Il fluire degli elettroni attraverso questi complessi transmembrana porta al trasporto di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. Gli elettroni sono portati dalla NADH-Q ossidoreduttasi alla Q-citocromo C ossidoreduttasi, il secondo complesso della catena, dalla forma ridotta del coenzima Q (Q) anche noto come ubichinone perchè è un chinone ubiquitarii nei sistemi biologici. Coenzima Q Derivato chinonico con una lunga coda isoprenoide. Il numero di unità isopreniche di 5 atomi di carbono dipende dalla specie. I mammiferi più comuni contengono 10 unità isopreniche (coenzima Q 10 ). I chinoni possono esistere in tre stati di ossidazione. Nello stato totalmente ossidato (Q) il coenzima Q ha due gruppi chetonici. L aggiunta di un elettrone e di un protone porta alla forma semichinonica (QH ). zymeq10.html Il semichinone è deprotonata in modo relativamente facile formando un anione radicalico semichinonico (Q ). L aggiunta di un secondo elettrone e di un protone genera il diidroubichinone (QH 2 ), la forma totalmente ridotta del coenzima Q che conserva I suoi protoni più strettamente. Perciò, per i chinoni, le reazioni di trasferimento di energia sono accoppiate al legame e rilascio di un protone, una proprietà che è fondamentale per il transporto dei protoni attraverso la membrana. La catena respiratoria consiste di quattro complessi: tre pompe protoniche e un collegamento fisico con il ciclo dell acido citrico (2) Struttura del coenzima Q (CoQ) o ubichinone, illustrante la sua capacità fi trasportare due protoni e due elettroni. L ubichinone è un chinone idrofobico che diffonde rapidamente all interno della membrana mitocondriale interna. L ubichinone trasporta gli elettroni dal FADH 2, generati dalla succinato deidrogenasi nel ciclo dell acido citrico, alla Q citocromo C ossidoreduttasi, generata mediante la succinato Q reduttasi. Il citocromo C, una piccola molecola solubile, fa da navetta per gli elettroni dalla Q citocromo C ossidoreduttasi alla citocromo C ossidasi, la componente finale della catena e quella che catalizza la riduzione dell O 2 ad H 2 O. 12

13 Struttura del citocromo c di cuore di cavallo La catena respiratoria consiste di quattro complessi: tre pompe protoniche e un collegamento fisico con il ciclo dell acido citrico (3) I citocromi sono emoproteine legate a membrane che contengono gruppi eme e sono coinvolte nel trasporto di elettroni La NADH Q ossidoreduttasi, la succinato Q reduttasi, la Q citocromo c ossidoreduttasi e la citocromo c ossidasi sono anche noti come Complessi I, II, III e IV, rispettivamente. La succinato Q reduttasi (complesso II), a differenza degli altri complessi, non pompa elettroni. Gli elettroni ad elevato potenziale del NADH entrano nella catena respiratoria a livello della NADH Q ossidoreduttasi Stati di ossidazione delle Flavine Gli elettroni del NADH entrano nella catena a livello della NADH Q ossidoreduttasi (NADH deidrogenasi), un enorme enzima /pompa protonica con almeno 34 catene polipeptidiche. La reazione catalizzata da questo enzima sembra essere: Il passo iniziale è il legame di NADH e il trasferimento dei suoi due elettroni ad elevata energia al gruppo prosptetico FMN (flavina mononucleotide) di questo complesso per dare la forma ridotta FMNH 2. Come i chinoni, anche il FMN può accettare un elettrone invece che due per formare un radicale semichinonico. L accettore di elettroni del FMN, l anello isoalloxazinico, è identico a quello del FAD. Gli elettroni vengono allora trasferiti dal FMNH 2 ad una serie di centri Fe- S, il secondo tipo di gruppi prostetici della NADH-Q ossidoreduttasi. La riduzione della flavina mononucleotide (FMN) FMNH 2 procede mediante un intermediario semichinonico. I centri Fe S nelle proteine ferro zolfo (dette anche proteine a ferro non emico) giocano un ruolo chiave in una gran diversità di reazioni biologiche di riduzione. Gli elettroni dei centri Fe S della NADH Q ossidoreduttasi sono convogliati al coenzima Q portando al pompaggio di quattro ioni di idrogeno dalla matrice del mitocondrio. La NADH Q ossidoreduttasi contiene clusters di tipo 2Fe 2S e di tipo 4Fe 4S. Gli atomi di ferro di questi complessi passano ciclicamente fra stati Fe 2+ (ridotto) o Fe 3+ (ossidati). Al contrario dei chinoni e delle flavine, i centri Fe S di solito subiscono ossidazione riduzione senza rilasciare o legare protoni. 13

14 Il diidroubichinone è il punto di ingresso degli elettroni del FADH 2 delle flavoproteine L enzima del ciclo dell acido citrico succinato deidrogenasi, che genera FADH 2 con l ossidazione del succinato in fumarato, fa parte del complesso succinato Q reduttasi (complesso III) una proteina integrale di membrana della membrana mitocondriale interna. Il FADH 2 non lascia il complesso [gruppo prostetico]; invece gli elettroni sono trasferiti a centri Fe S e successivamente al Q per dare entrata nella catena di trasporto degli elettroni. Il complesso succinato Q reduttasi, e altri enzimi che trasferiscono gli elettroni del FADH 2 a Q, al contrario della NADH Q ossidoreduttasi, non trasportano protoni. Perciò, si forma meno ATP dall ossidazione del FADH 2 che non del NADH: Quinones Each of these electron carriers in the respiratory chain picks up one H + from the aqueous environment for every electron it accepts, and it can carry either one or two electrons as part of a hydrogen atom (yellow). When it donates its electrons to the next carrier in the chain, these protons are released. In mitochondria the quinone is ubiquinone (coenzyme Q), shown here; the long hydrophobic tail, which confines ubiquinone to the membrane, consists of 6 to 10 five carbon isoprene units, depending on the organism. The corresponding electron carrier in plants is plastoquinone, which is almost identical. For simplicity, both ubiquinone and plastoquinone will normally be referred to as quinone and abbreviated as Q. Gli elettroni fluiscono dall ubichinolo al citocromo C tramite la Q citocromo C ossidoreduttasi La seconda delle tre pompe protoniche della catena respiratoria è la Q citocromo c ossidrduttasi (Complesso III o citocromo ossidasi). Un citocromo è una proteina che trasferisce elettroni che contiene un gruppo prostetico eme. Il ferro del gruppo prostetico alterna fra uno stadio ridotto ferroso (Fe 2+ ) e uno stato ossidato ferrico (Fe 3+ ) durante il trasporto degli elettroni. La funzione della Q citcromo C ossidoreduttasi è quella di catalizzare la trasferta di elettroni dal QH 2 al citocromo c ossidato (Cyt c), una proteina solubile in acqua, e concomitantemente pompare elettroni fuori dalla matrice mitocondriale. Un gradiente protonico fornisce l energia per la sintesi dell ATP (1) Il flusso di elettroni dal NADH all O 2 è un processo esergonico: Questo processo è accoppiato alla sintesi di ATP, un processo endergonico: Mitocondri SINTESI DELL ATP La sintesi dell ATP è svolta da un complesso molecolare presente nella membrana mitocondriale interna: Noto precedentemente come F 1 F 0 ATPase perchè è stato scoperto mediante la sua catalisi del processo inverso, l idrolisi dell ATP. ATP sintasi è il nome preferibile perchè enfatizza il suo ruolo reale nel Viene anche chiamato Complesso V. 14

15 Un gradiente protonico fornisce l energia per la sintesi dell ATP (2) In 1961, Peter Mitchell propose che il trasporto degli elettroni e la sintesi dell ATP fossero accoppiati mediante un gradiente protonico attraverso la membran mitocondriale interna, piuttosto che mediante un intermediario covalente ad alta energia. Nel suo modello, il trasferimento di elettroni lungo la catena respiratoria portavaal pompaggiodi protonidalla matrice allo spazio fra la membrana mitcondriale interna e quella esterna La concentrazione di H + diventa minore nella matrice, e viene generato un campo elettrico in cui il lato della matrice è negativo rispetto allo spazio intermembrane. [n protoni inferiore rispetto allo spazio intermembrane] Structure of ATP Synthase Figure Structure of ATP Synthase. A schematic structure is shown along with detailed structures of the components for which structures have been determined to high resolution. The P-loop NTPase domains of the α and β subunits are indicated by purple shading. only 15

16 Il gradiente protonico pilota la sintesi dell ATP (1) Il gradiente elettrochimico protonico attraverso la membrana mitocondriale interna è il processo fondamentale della fosforilazione ossidativa. Questa è svolta mediante un enzima legato alla membrana interna, l ATP sintasi. L ATP sintasi crea una via idrofilica attraverso la membrana interna che permette il flusso di protoni lungo il loro gradiente elettrochimico. Mentre i protoni si incanalano lungo l ATP sintasi, essi sono usati per pilotare la reazione energeticamente sfavorevole fra l ADP e il P i che permette il ripristino dell ATP. Natura elettrochimica del gradiente protonico CHEMIOSMOSI (1) Dato che i protoni sono carichi positivamente, il gradiente protonico stabilito attraverso la membrana mitocondriale interna ha componenti sia chimiche che elettriche. La componente chimica è la concentrazione di protoni, o gradiente protonico, che corrisponde ad una concentrazione circa dieci volte superiore di protoni nel versante citosolico della membrana mitcondriale interna (differenza di una unità di ph). Inoltre, vi è un potenziale elettrico attraverso la membrana, che deriva dall aumento netto di cariche positive sul versante citosolico. 16

17 CHEMIOSMOSI (2) Il NADH e il FADH 2 trasportano protoni (H + ) ed elettroni (e ) alla catena di trasporto di elettroni localizzata sulla membrane mitocondriale interna. L energia del trasferimento di elettroni lungo la catena trasporta dei protoni attraverso la membrana crea un gradiente elettrochimico. Man mano che i protoni che si accumulano seguono il gradiente elettrochimico di ritorno attraverso la membrane lungo un complesso ATP sintasi, il movimento dei protoni fornisce l energia per sintetizzare ATP a partire dall ADP e fosfato. Alla fine del sistema di trasporto di elettroni, due protoni, due elettroni e una metà di una molecola di ossigeno si combinano per formare acqua. Poichè l ossigeno è l accettore finale degli elettroni, il processo è detto respirazione aerobica. The ATP synthase is a reversible coupling device that can convert the energy of the electrochemical proton gradient into chemical-bond energy, or vice versa Mitocondri TRASPORTATORI E NAVETTE SULLE MEMBRANE MITOCONDRIALI 17

18 Trasportatori sulla membrana mitocondriale interna Trasporto di metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna (1) ure/a4418/ Trasporto di metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna (2) Il trasporto di piccolo molecule attraverso la membrane interna è mediato da proteine di trasporto che attraversano la membrana e guidato dal gradiente elettrochimico. Ad esempio, l ATP viene esportato dai mitocondri verso il citosol da un trasportatore che lo scambia con l ADP. La componente di voltaggio del gradiente elettrochimico guida questo scambio: l ATP porta una maggiore carica negativa ( 4) dell ADP ( 3), e perciò l ATP é esportato dalla matrice mitocondriale al citosol mentre l ADP viene importato verso i mitocondri. Viceversa, il trasporto del fosfato (P i ) e del piruvato é accoppiato ad uno scambio con ioni idrossilici (OH ); in questo caso, la componente di ph del gradiente elettrochimico guida l esportazione degli ioni idrossilici, accoppiata al trasporto di P i e piruvato verso i mitocondri. Mitocondri NAVETTE PER IL NADH FORMATO NEL CITOSOL Glycerol 3-Phosphate Shuttle Electrons from NADH can enter the mitochondrial electron transport chain by being used to reduce dihydroxyacetone phosphate to glycerol 3-phosphate. Glycerol 3-phosphate is reoxidized by electron transfer to an FAD prosthetic group in a membrane-bound glycerol 3-phosphate dehydrogenase. Subsequent electron transfer to Q to form QH 2 allows these electrons to enter the electron-transport chain. Mitocondri ULTRASTRUTTURA 18

19 Cellule parietali dello stomaco: secernono acido cloridrico Tubuli renali 1.shtml Tubuli distali del nefrone: riassorbono sodio dall ultrafiltrato contro gradiente JC 1 Dye Mitchondrial Membrane Potential Probe Mitocondri FLUOROCROMI Health-and-Viability-Assays-for-Flow-Cytometry/Apoptosis-Assays-for-Flow-Cytometry/JC-1-Dye-Mitochondrial- Membrane-Potential-Probe.html 19

20 Membrane mitocondriali JC 1 Fig. 1. Cultured human bronchial smooth muscle cell stained with mitochondrial membrane potential indicator JC-1. Red area correspond to energized mitochondria with highly negative membrane potential. PlanApo x oil immersion objective, CARV II preset filters/mirror combinations - GREEN and RED. Potential-dependent staining of mitochondria in CCL64 fibroblasts by JC-1 (T3168). The mitochondria were visualized by epifluorescence microscopy using a 520 nm longpass optical filter. Regions of high mitochondrial polarization are indicated by red fluorescence due to J-aggregate formation by the concentrated dye. Depolarized regions are indicated by the green fluorescence of the JC-1 monomers. The image was contributed by Lan Bo Chen, Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School. Detail.alternateID.g html Βeta ossidazione degli acidi grassi Mitocondri_seminario Β ossidazione degli acidi grassi Anche gli enzimi che degradano gli acidi grassi derivati dai trigliceridi producono acetil CoA nei mitocondri. Ogni molecola di acido grasso, sotto forma attivata di acil CoA, viene degradata completamente mediante un ciclo di reazioni che scinde due carboni alla volta a partire dall estremità carbossilica, generando una molecola di acetil CoA ad ogni giro del ciclo. In questo processo sono prodotte una molecola di NADH e una molecola di FADH 2. Gli acidi grassi sono ossidati sopratutto nei mitocondri. [N.B. L inizio della degradazione degli acidi grassi a catena molto lunga si svolge nei perossisomi]. Gli acidi grassi debbono essere attivati prima di entrare nella matrice mitondriale. L adenosina trifosfato (ATP) pilota la formazionedi un legame tioester fra il gruppo carbossilico di un acido grasso e il gruppo sulfidrilico del CoA. Questo processo di attivazione si svolge nella membrana mitocondriale esterna, dove è catalizzato dalla acil CoA sintetasi

21 La Carnitina trasporta gli acidi grassi a catena lunga attivati verso la matrice mitocondriale Gli acidi grassi sono attivati nella membrana mitocondriale esterna mentre sono ossidati nella matrice mitocondriale. E necessario un meccanismo speciale per trasportare le molecole a lunga catena di acil Coa attraverso la membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi attivati sono trasportati attraverso la membrana mediante cconiugazione con la carnitina, un alcool zwitterionica. Il gruppo acilico è trasferito dall atomo di zolfo del CoA al gruppo idrossilico della canitina formando acil carnitina. Questa reazione è catalizzata dalla carnitine aciltrasferasiche è legata alla membrana mitocondriale esterna. Acil Carnitine Traslocasi L entrata della acilcarnitina nella matrice mitocondriale è mediata da una traslocasi. La carnitina ritorna al lato citosolico della membrana mitocondriale internamediante scambio con l acil carnitina. Trasporto dell Acil-CoA dal citosol alla matrice mitocondriale Schema dell ossidazione degli acidi grassi Oxidation of fatty acids in mitochondria Four enzyme-catalyzed reactions convert a fatty acyl CoA molecule to acetyl CoA and a fatty acyl CoA shortened by two carbon atoms. Concomitantly, one NAD + molecule is reduced to NADH and one FAD molecule is reduced to FADH 2. The cycle is repeated on the shortened acyl CoA until fatty acids with an even number of carbon atoms are completely converted to acetyl CoA. Fatty acids with an odd number of C atoms are rare; they are metabolized to one molecule of propionyl CoA and multiple acetyl CoA molecules. objectonly 21