Monitoraggio fitopatologico di specie di. Fusarium micotossigene presenti su. varietà di frumento duro e tenero e

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1 Workshop MICPRINCEM Micotossine principali ed emergenti nei cereali Monitoraggio fitopatologico di specie di Fusarium micotossigene presenti su varietà di frumento duro e tenero e caratterizzazione di una collezione di Fusarium langsethiae Dr. Alessandro Infantino CRA-PAV 1

2 Micotossine prodotte da Fusarium spp. associate a frumento Fusarium spp Micotossine F. graminearum DN, Ac-DN, ZEA, NIV, FUS F. culmorum DN, Ac-DN, ZEA, NIV, FUS, F. poae DAS, MAS, NIV, FUS, T-2, T-2 F. avenaceum MN, BEA, ENS F. equiseti DAS, ZEA F. crokwellense NIV, FUS X, ZEA F. sambucinum T-2, T-2, DAS, MAS, MN, NE F. acuminatum DAS, MAS, ENS F. sporotrichioides T-2, T-2, DAS, NE F. langsethiae T-2, T-2, DAS, NE F. tricinctum MN F. subglutinans MN, BEA, FUP F. oxysporum MN, BEA, ENS F. proliferatum FB S Visconti and Pascale, 2010, Cereal Chem. 87(1): 21 27) Ac-DN = 3- or 15-acetyldeoxynivalenol; BEA = beauvericin; DAS = diacetoxyscirpenol; DN = deoxynivalenol; ENS = enniatins; FBs = fumonisins B1, B2 and B3; FUP = fusaproliferin; FUS = fusarenone-x; T-2 = T-2 toxin; MAS = monoacetoxyscirpenol; MN = moniliformin; NE = neosolaniol; NIV = nivalenol; T-2 = T-2 toxin; ZEA = zearalenone. 2

3 Fusariosi della spiga - FB Fusarium graminearum Fusarium culmorum Fusarium avenaceum Fusarium poae Microdochium nivale 3

4 Fusarium langsethiae 4

5 Identificazione morfologica Inquadramento filogenetico elongation factor-1 alpha (EF-1a) aspetto polverulento della colonia presenza di polifialidi assenza di macroconidi; Assenza di clamidospore; assenza del tipico odore di pesca. accrescimento medio giornaliero su PDA a 25 C più lento rispetto a F. poae e F. sporotrichioides Knutsen, M. Torp, A. olst-jensen. International Journal of Food Microbiology 95 (2004)

6 Monitoraggio con metodi convenzionali Deep freezing blotter test posa 24h NUV, +23 C 24h, -20 C registrazione dati lettura 6-8 gg NUV, +23 C 6

7 Monitoraggio con metodi convenzionali Deep freezing blotter test 7

8 Monitoraggio con metodi molecolari PCR QUALITATIVA PCR QUANTITATIVA (SYBR Green) F. graminearum Fg16F / Fg16FR (Nicholson et al., 1998 ) F. culmorum FC01F / FC1R (Nicholson et al., 1998 ) F. langsethiae FlangF3 / LanspoR1 (Wilson et al., 2004) F. graminearum + F. culmorum F22 F / F22 R (Terzi et al., 2007) F. langsethiae FlangA29 / FlangA95 (Nicolaisen et al. 2009) 8

9 Monitoraggio con metodi convenzionali frumento duro varietà località Kanakis Ramirez Sculptur Creso Claudio Simeto Ciccio Duilio Dylan Iride ciclo MP/M M M T M MP P P T P Conselice (RA) S.A. Lodig. (L) Agugliano (AN) Tolentino (MC) Grosseto Foggia Libertinia (CT) Larino (CB) Calitri (AV) ttava (SS) Roma frumento tenero località Conselice (RA) Torino Roma Foggia varietà Bologna Bandera ciclo MT P Lista e località di coltivazione delle varietà oggetto di studio Totale: 86 campioni

10 Monitoraggio con metodi convenzionali year no. of samples Fusariosi della spiga DN (ppb) Incidence of total Fusarium (%) Incidence of Fusarium DN producers North Centre South North Centre South North Centre South Year Correlation corr (r) S.E. of r P (r = 0) n 2007 DN vs incidence of total Fusarium (%) ** 29 DN vs incidence of F.g + F.c *** DN vs incidence of total Fusarium (%) *** 34 DN vs incidence of F.g + F.c *** DN vs incidence of total Fusarium (%) * 16 DN vs incidence of F.g + F.c *** DN vs incidence of total Fusarium (%) * 62 DN vs incidence of F.g + F.c * 62 10

11 Monitoraggio con metodi convenzionali MICPRINCEM 2011 località DN (ppb) totale FUSARIUM F. graminearum F. culmorum F. avenaceum F. poae F. langsethiae M. nivale F. subglutinans F. equiseti F. verticillioides F. proliferatum F. semitectum F. chlamydosporum F. sambucinum F. tricinctum F. sporotrichioides F. crookwellense Fusarium spp. Agugliano AN) 489,5 18,3 0,7 0,0 0,1 3,2 1,7 0,0 0,4 0,3 0,8 4,0 0,3 0,0 0,0 3,1 0,7 0,1 2,9 Libertinia (CT) 311,8 12,4 0,0 0,5 0,4 9,0 0,9 0,0 0,1 0,1 0,1 0,0 0,3 0,1 0,8 0,0 0,1 0,0 0,2 Conselice (RA) 225,6 9,1 0,1 0,0 0,2 5,1 1,8 0,0 0,0 0,0 0,4 0,6 0,1 0,2 0,1 0,2 0,4 0,0 0,2 S. Angelo Lodigiano (L) 92,3 22,1 0,4 0,1 1,3 0,5 0,0 0,2 2,3 0,6 2,5 11,4 0,6 0,1 0,4 0,3 0,1 0,1 1,6 Grosseto 77,1 4,8 0,0 0,4 0,0 3,0 0,8 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,1 0,0 0,0 0,2 0,0 0,1 0,2 Foggia 36,3 4,2 0,0 0,0 0,0 0,0 2,5 0,0 0,1 0,0 0,6 0,3 0,0 0,3 0,1 0,2 0,0 0,0 0,2 Tolentino (MC) 22,8 6,3 0,0 0,0 0,2 0,7 1,4 2,9 0,0 0,0 0,2 0,2 0,0 0,1 0,0 0,6 0,0 0,0 0,2 varietà Simeto 316,6 12,3 0,1 0,4 0,3 3,9 1,6 0,2 0,1 0,0 0,4 1,7 0,5 0,3 1,2 0,9 0,2 0,0 0,5 Creso 302,7 13,5 0,0 0,2 0,3 3,0 0,9 0,1 0,9 0,3 0,4 4,1 0,1 0,1 0,1 1,3 0,3 0,0 1,4 Duilio 248,6 7,9 0,1 0,1 0,4 2,8 1,2 0,2 0,4 0,0 1,2 0,4 0,0 0,1 0,0 0,5 0,1 0,1 0,3 Kanakis 217,7 10,9 0,3 0,1 0,4 2,4 0,7 0,6 0,2 0,1 1,2 3,2 0,1 0,2 0,1 0,5 0,2 0,0 0,5 Dylan 198,7 8,8 0,2 0,1 0,7 2,1 0,8 1,4 0,4 0,4 0,1 1,1 0,2 0,1 0,1 0,5 0,1 0,0 0,2 Claudio 142,6 11,1 0,2 0,1 0,4 2,4 2,3 0,1 0,1 0,1 0,2 2,1 0,6 0,0 0,1 0,4 0,5 0,1 1,4 Iride 99,0 10,7 0,1 0,1 0,1 2,4 1,0 0,1 0,1 0,1 1,5 3,7 0,1 0,1 0,1 0,8 0,1 0,0 0,4 Sculptur 97,1 16,8 0,2 0,0 0,4 7,4 2,9 1,2 0,4 0,0 0,9 1,8 0,1 0,0 0,1 1,0 0,1 0,0 0,5 Ramirez 93,6 8,5 0,6 0,0 0,1 1,1 0,3 0,4 1,1 0,0 0,5 2,8 0,1 0,2 0,0 0,3 0,0 0,1 1,0 Ciccio 76,9 9,6 0,0 0,1 0,0 2,9 1,1 0,1 0,5 0,2 0,2 2,6 0,0 0,0 0,0 0,4 0,1 0,0 1,4 media 11,0 0,2 0,1 0,3 3,1 1,3 0,4 0,4 0,1 0,7 2,4 0,2 0,1 0,2 0,7 0,2 0,0 0,8 Micotossine principali ed emergent inei cereali CRA, 18 Aprile

12 Monitoraggio con metodi convenzionali Fusarium langsethiae Year rigin Total samples Samples positive for F. langsethiae range of incidence of F. langsethiae on positive samples 2007 Northern Italy Central Italy Southern Italy Northern Italy Central Italy Southern Italy Northern Italy Central Italy Southern Italy Northern Italy Central Italy Southern Italy Total

13 Monitoraggio con metodi molecolari Fusariosi della spiga Correlazione corr (r) S.E. of r P (r = 0) n (2007; 2008; 2009; 2011) DNA vs incidenza DN produttori *** 123 DNA DN produttori vs DN *** 123 Fusarium langsethiae Correlazione corr (r) S.E. of r P (r = 0) n (2009; 2011) incidenza F. langsethiae vs T2 + T *** 33 incidenza vs DNA F. langsethiae *** 82 T2 + T2 vs DNA F. langsethiae ns 31 13

14 Caratterizzazione collezione F. langsethiae # mm d -1 Non-significant ranges a a b c c c cd ce cf df df eg fg fh gi hi i i i i j j j j 24 isolati 3 temperature (15 C, 25 C, 30 C) 3 rip/isolato Temperatura ottimale di crescita = 25 C 14

15 Caratterizzazione collezione F. langsethiae Patogenicità in serra Frumento duro var. Simeto (concentrazione inoculo: , , ) Avena var. Argentina (conc inoculo: , , ) Isolato utilizzato: F. langsethiae CRA-PAV ER 1400 Fase fenologica: botticella No sintomi su spighe / pannocchie a maturità 15

16 Caratterizzazione collezione F. langsethiae Inoculazioni artificiali in campo Tesi Epoche di inoculo Ripetizioni F1: F. langsethiae ER 1400 T1: inoculazione alla fioritura I F2: F. langsethiae ER 1402 T2: inoculazione alla maturazione lattea II F3: F. langsethiae ER 1409 T3: inoculazione alla maturazione cerosa III Testimone nebulizzato non inoculato # flowering early milk early douhg mean ER , a ER a ER a TEST b 2009 mean 11.2 a 15.2 a 15.4 a # flowering early milk early dough mean ER a ER a ER a TEST b 2011 mean 4.8 a 7.9 b 8.4 b 16

17 Produzione micotossine Coltura F. langsethiae su cariossidi di frumento (28 isolati) Estrazione con acetonitrile/acqua (84:16) Purificazione su colonnina Mycosep#227 Analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS/MS) Identificazione e caratterizzazione strutturale dei metaboliti prodotti

18 Caratterizzazione collezione F. langsethiae Produzione micotossine Con l eccezione di ER 1439, tutti gli isolati hanno prodotto le tossine T2, T-2 e Neosolaniolo (NE). Solo 9 isolati su 28 hanno prodotto Diacetossiscirpenolo (DAS). Correlazione non significativa tra la quantità di micotossine prodotte e biomassa di F. langsethiae Il range di concentrazione delle diverse micotossine è stato: Da 0.35 a mg/kg per T-2; Da 1.27 a mg/kg per T-2; Da 0.01a mg/kg per DAS; Da 0.74 a mg/kg per NE Micotossine principali ed emergentinei cereali CRA, 18 Aprile

19 Identificazione e caratterizzazione di forme glicosilate di tricoteceni di tipo A prodotte da Fusarium langsethiae Nell ambito del progetto è stata condotta una indagine sulla capacità degli isolati di F. langsethiae di produrre forme glicosilate dei tricoteceni di tipo A. Forme Glicosilate dei Tricoteceni Prodotte dal fungo Interazioni pianta-patogeno: detossificazione LLe forme glicosilate dei tricoteceni possono liberare per idrolisi le forme native durante i processi di trasformazione o durante i processi digestivi se ingerite attraverso alimenti contaminati. Esse pertanto possono contribuire alla tossicità globale. Micotossine principali ed emergentinei cereali CRA, 18 Aprile 2013

20 E stata dimostrata la capacità da parte dei ceppi isolati di produrre, insieme alle forme native dei tricoteceni A, anche piccole quantità di tossina glicosilata. C 3 ( 3 C) 2 C 2 CC 3 C 3 CC CC 3 C 3 ( 3 C) 2 C 2 CC C 3 CC 3 T-2 glucoside T-2 glucoside C 3 C 3 CC 3 C 3 C 3 CC 3 CC 3 CC 3 NE glucoside DAS glucoside Le forme glicosilate del DAS e NE sono state identificate e caratterizzate per la prima volta. Micotossine principali ed emergentinei cereali CRA, 18 Aprile 2013

21 Conclusioni Annata agraria poco favorevole a FB Diffusa presenza di F. langsethiae in Italia, bassi valori di incidenza Scarsa/nulla patogenicità di F. langsethiae su frumento duro in prove di inoculazione artificiale in serra e in campo Elevata potenzialità micotossigenica in vitro Prima segnalazione di forme glicosilate di DAS e NE Necessità di ulteriori studi per chiarire aspetti epidemiologici e di interazione di F. langsethiae con il frumento Micotossine principali ed emergentinei cereali CRA, 18 Aprile

22 Ringraziamenti Dott. A. Santori, Sig. G. Di Giambattista, Dott.ssa S. De Felice, Dott.ssa L. Tizzani (CRA-PAV) Dott. F. Quaranta, Dott.ssa A. Belocchi, Dott. M. Fornara; Dott.ssa Gabriella Aureli, Dott.ssa Maria Grazia D Egidio (CRA-QCE) Dott. M. Pascale, Dott.ssa V. Lattanzio, Dott.ssa M. aidukowski (ISPA-CNR Bari) Micotossine principali ed emergentinei cereali CRA, 18 Aprile