ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO. ANIMALI TRANSGENICI -modelli di malattia -xenotrapianti -bioreattori
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- Sofia Mosca
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1 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO RICERCA CELLULE IN COLTURA -Struttura,funzione e regolazione di un gene -Produzione di proteine (anche farmaci)? ANIMALI TRANSGENICI -modelli di malattia -xenotrapianti -bioreattori TERAPIA GENICA -Ripristino vie metaboliche -Aumento difese
2 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO VETTORI NON VIRALI SOLO ARTIFICIALI: NON ESISTONO IN NATURA PLASMIDI PER CELLULE DI MAMMIFERO VETTORI VIRALI DERIVATI DA VIRUS NATURALI
3 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI O VETTORI VIRALI
4 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI Origine di replicazione Generalmente da virus animali (SV40) GENE TARGET Promotori (Enhancer/Silencer) eterminatori Generalmente da: virus animali SV40, cytomegalovirus (CMV), herpes simplex virus (HSV)..o geni di mammifero altamente espressi: actina β, timidina chinasi, ormone della crescita bovino 3 UTR e Sito Poliadenilazione - a valle della sequenza codificante necessarie perla corretta sintesi e poliadenilazione di mrna Sequenze introniche Tra promotore e gene
5 MARCATORI SELEZIONABILI MARCATORI DI ORIGINE BATTERICA Neo r : neomicina fosfotrasferasi batterica G-418 (geneticina) / blocca la traduzione e uccide la cellula COMPLEMENTAZIONE DI VIE METABOLICHE INTERROTTE DHFR: gene per diidrofolato reduttasi Utilizzabile con cellule DHFR- Conferisce resistenza a Metotrexato (MTX)
6 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI VETTORI CONTENENTI PIU GENI
7 VETTORI DICISTRONICI IRES= Internal Ribosome Entry Site
8 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione) Trasformazione (microoorganismi) Trasfezione (eucarioti) Infezione (se il vettore è un virus) Tecniche (chimiche e fisiche) Uso di sostanze permeabilizzanti Elettroporazione liposomi Bombardamento con microparticelle Microiniezione
9 ESPRESSIONE TRANSIENTE O STABILE?
10 ESPRESSIONE TRANSIENTE EPISOMALE: SV40 E ANTIGENE T
11 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI NON VIRALI VANTAGGI NO nuovi virus patogeni RIDOTTO rischio di reazione immunitaria SI al trasferimento di molti tipi di DNA anche molto grandi SI alla produzione in grandi quantità a basso costo SVANTAGGI BASSA efficienza di trasduzione e di integrazione (effetti non duraturi) ALTA probabilita di mutagenesi inserzionale
12 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI VIRALI IL GENE TARGET VIENE INSERITO NEL GENOMA VIRALE sotto il controllo di un promotore forte. IL VIRUS ORIGINALE E DIFETTIVO (no replicazione autonoma) LE PARTICELLE VIRALI RICOMBINANTI VENGONO PRODOTTE IN LINEE CELLULARI SPECIALI (linee di packaging). Queste complementano i difetti presenti nel genoma virale.
13 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: QUALI VIRUS? Retrovirus : infettano solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale (murini) Lentivirus : derivati del virus HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.
14 I ESEMPIO: I RETROVIRUS virus con envelope genoma =10 Kb ssrna retrotrascritto a dsdna dopo infezione si integra nel genoma dell ospite (possibile mutagenesi) infetta solo celule in divisione
15 RETROVIRUS LTR Ψ gag pol env LTR gag: proteine del core pol: trascrittasi inversa env: proteine dell envelope LTR: long terminal repeat= promotore/enhancers e sequenze necessarie per l integrazione ψ: sequenze per il packaging RETROVIRUS DIFETTIVI NELLA REPLICAZIONE LTR Ψ LTR Ψ LTR Ψ gag pol env cdna LTR neo promoter cdna LTR LTR Mantenuta la regione LTR e sequenza di packaging (elementicis). Promotore: virale o eucariotico Marker di selezione (es. neomicina). Dimensione max del transgene: 7.5 Kb.
16 E LE PROTEINE NECESSARIE PER LA REPLICAZIONE? LINEA CELLULARE DI PACKAGING VIRUS HELPER
17 ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO: VETTORI VIRALI VANTAGGI ALTA efficienza di trasduzione SVANTAGGI SI nuovi virus patogeni per ricombinazione con virus presenti nell ospite SI Mutagenesi inserzionale (solo quelli ad integrazione casuale) LIMITE alle dimensioni de DNA SI Reazioni immunitarie SI Costi elevati
18 ESPRESSIONE IN CELLULE IN COLTURA (Cellule da tessuto immortalizzate*) Svantaggi: Difficile scale-up Tempi lunghi Rese basse Problemi di sicurezza *CHO (Chinese Hamster Ovary) 3T3 BHK (Baby hamster kidney) Ibridomi (anticorpi) Ecc..
19 LA RESA IN PROTEINA E STATA MOLTO MIGLIORATA.
20 GLI ORGANISMI TRANSGENICI COMPLESSI Ruolo Gene/proteina in un contesto fisiologico Modelli animali di malattie Xenotrapianti Bioreattori per produrre proteine DUE TIPI DI ESPERIMENTI
21 I TOPI TRANSGENICI Il metodo delle cellule staminali embrionali (ES) Pluripotenti= formano tutti tessuti Singola cellula = rosa o gialla
22 Piante ed animali transgenici come bioreattori. -Vantaggi: possibilità di facilitare la purificazione del prodotto se questo si trova in una parte commestibile e conservabile (semi, latte). Bassi costi di produzione. Il gene si introduce per microiniezione nell ovulo o nell embrione (1-2 cellule) Il promotore si attiva in tessuti e momenti dello sviluppo specifici Svantaggi: Il primo animale è molto costoso Tempi di generazione e resa Controllo dei dosaggi Problemi di Biosicurezza Ruminanti non fanno tutte le modificazioni post-traduzionali
23 DOVE SI PRODUCONO LE PROTEINE RICOMBINANTI? LATTE BOVINI OVINI SUINI UOVA UCCELLI 3 settimane 20 settimane SANGUE (-) 300 UOVA/ANNO (100 mg/uovo)
24 950 USD/g ( cellule coltura) 700 USD/g (transgene)
25 ALCUNE APPLICAZIONI SPERIMENTALI: I VACCINI A DNA
26 I VACCINI A DNA PRODUCONO GLI ANTIGENI DIRETTAMENTE NELL OSPITE
27 I VACCINI A DNA PRODUCONO GLI ANTIGENI DIRETTAMENTE NELL OSPITE
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