CREAZIONE DELLA BANCA DEL GERMOPLASMA DELLA VALLE D AOSTA, CON IL SUPPORTO DELLA

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1 CREAZIONE DELLA BANCA DEL GERMOPLASMA DELLA VALLE D AOSTA, CON IL SUPPORTO DELLA CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI SPECIE VEGETALI DI INTERESSE REGIONALE RICERCATORE TEAM LEADER: FABIO GUGLIELMO

2 INTRODUZIONE: DEFINIZIONE E FINALITÀ BANCA DEL GERMOPLASMA Struttura per la conservazione ex situ a lungo termine di specie vegetali Crioconservazione di materiale in grado di dare origine a nuovi individui Reintroduzione e recupero di habitat Ricerca biologia ecologia specie Risposta attiva a perdita di biodiversità

3 INTRODUZIONE LEGISLAZIONE CONSERVAZIONE SPECIE PANORAMA NAZIONALE ED INTERNAZIONALE Piano Nazionale sulla Biodiversità (DM 97/568) A livello mondiale: 1700 Banche del germoplasma Millenium Seed Bank dei Kew Gardens di Londra Numerose reti internazionali (ENSCONET) A livello italiano: 20 banche (fino al 2014 non presente in VDA) Rete nazionale (RIBES)

4 INTRODUZIONE FASI OPERATIVE BANCA DEL GERMOPLASMA Pianificazione e Raccolta Sopralluogo stazioni prelievo e raccolta dati Selezione popolazioni da campionare Campionamento semi maturi (<20% semi disponibili) Preparazione Pulizia e controllo maturità semi Test germinabilità iniziale Deidratazione (15-20% UR C) Conservazione Impacchettamento Crioconservazione (-20 C): collezione di base e collezione attiva Verifica Verifica germinabilità iniziale Verifica vitalità lotti Rigenerazione e duplicazione

5 INTRODUZIONE PIANIFICAZIONE E RACCOLTA: PUNTI CRITICI Individuazione e identificazione specie su base morfologica Piante ad uno stadio giovanile Plasticità fenotipica Specie criptiche DNA barcoding Strategia di campionamento Biologia specie Più popolazionipiù individui Campioni non rappresentativi delle risorse genetiche disponibili Accessioni ridondanti DNA genotyping

6 INTRODUZIONE DNA BARCODING Hebert et al. 2003: strumento di identificazione specifica Analisi di una corta porzione di DNA con bassa variabilità intraspecifica ed alta variabilità interspecifica Etichetta per l identificazione Strumento rapido, accurato ed automatizzabile Universale Qualità della sequenza Potere di discriminazione Animali: marker mitocondriale CO1 Piante: combinazione di due marker plastidiali (CBOL 2009) + altri marker supplementari

7 INTRODUZIONE DNA GENOTYPING Strumento di identificazione sub-specifica Analisi di porzioni ipervariabili Loci microsatellite o SSR (Simple Sequence Repeats): motivi ripetuti in tandem (1-6 nucleotidi); porzioni fiancheggianti relativamente conservate Analisi della lunghezza dei loci (o N. repeats) Locus (act): A: 20 repeats B: 22 repeats Tecnologia Next Generation Sequencing: individuazione loci STR più semplice e meno costosa =

8 OBIETTIVI Valutare l efficienza di differenti DNA barcode per l identificazione di specie vegetali spontanee da conservare ex situ Valutare la diversità genetica intra e inter popolazioni di alcune delle specie vegetali da conservare ex situ tramite marker SSR Prove preliminari per l allestimento della banca del germoplasma vegetale della Valle d Aosta

9 Criterio di rarità e vulnerabilità LR 45 del 07/12/2009 (All. A) Lista Rossa e Nera della flora vascolare della Valle d Aosta (Poggio et al. 2010) Libro Rosso delle Piante d Italia (Conti et al. 1992) Direttiva 92/43/CEE «Habitat» Convenzione di Berna (1979) Convenzione di Washington (1973) 23 specie DNA Barcoding e prove di conservazione ex situ MATERIALI E METODI SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI

10 MATERIALI E METODI SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI 5 specie DNA Genotyping

11 MATERIALI E METODI INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI Dati bibliografici, Database FLORA Coordinate UTM di ciascuna stazione 47 stazioni 18 comuni Procedura operativa standard Campionatori: Laura Poggio Claretta Christille Isabella Vanacore Falco Nicola Gérard Pierluigi Guglielmo

12 MATERIALI E METODI INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI Almeno 3 individui a stazione

13 MATERIALI E METODI ESTRAZIONE DEL DNA

14 MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: MARKER SAGGIATI Marker plastidiali 1. rbcl (600 bp): RUBISCO Facilmente amplificabile e sequenziabile Qualità sequenze elevata Basso potere discriminatorio 2. matk (900 bp): Maturasi K Elevato potere discriminatorio Qualità sequenze elevata Non sempre amplificabile 3. trnh-psba ( bp): Spaziatore intergenico Elevato potere discriminatorio Qualità sequenze bassa Difficile allineamento Marker nucleare 4. ITS ( bp): Spaziatori interni trascritti Elevato potere discriminatorio Possibilità copie paraloghe Possibilità contaminazione fungina

15 MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: FASI OPERATIVE Polymerase Chain Reaction (PCR) Elettroforesi su gel di agarosio Purificazione prodotti PCR Cycle sequencing Purificazione prodotti Elettroforesi a capillari Editing sequenze

16 Qualità amplificazione PCR Barcode universale? MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: VALUTAZIONE EFFICIENZA Prodotti PCR su gel dopo elettroforesi Qualità della sequenza Barcode accurato? Elettroferogramma forward e reverse Efficienza di discriminazione Barcode specifico?

17 MATERIALI E METODI PROVE DNA GENOTYPING: MARCATORI STR TRAMITE NGS 200 Mbp di sequenze a specie Ricerca 30 loci STR e disegno primer Selezione loci STR polimorfici

18 MATERIALI E METODI PROVE DNA GENOTYPING STRATEGIA DI CAMPIONAMENTO A B C 4 4 Analisi loci SSR A 4 B 4 C Pochi individui in tutte le popolazioni A 4 B 4 C Tanti individui da una popolazione A 4 B 4 C Tanti individui da tutte le popolazioni

19 MATERIALI E METODI PROVE DI CONSERVAZIONE EX SITU Prove preliminari di conservazione ex situ Allestimento banca Campionamenti (<20% semi disponibili) Pulizia semi (setacci, pennelli, stereomicroscopio) Prove deidratazione (3,5%-6,5% UR) Impacchettamento e crioconservazione Prove di germinazione iniziale

20 RISULTATI CAMPIONAMENTI Specie vegetale Campioni raccolti Stazioni indagate Aethionema thomasianum 26 3 Anemone narcissiflora 5 1 Astragalus alopecurus 15 4 Carex atrofusca 3 1 Carex otrubae 0 0 Cladium mariscus 3 1 Coincya richeri 6 2 Cypripedium calceolus 16 3 Dactylorhiza cruenta 6 2 Epipactis palustris 56 6 Fritillaria orientalis 0 2 Gladiolus palustris 0 2 Iris sibirica 0 2 Matteuccia struthiopteris 0 0 Potentilla multifida 3 2 Potentilla palustris 4 1 Potentilla pensylvanica 25 3 Salvia aethiopis 5 1 Schoenus ferrugineus 6 2 Trifolium saxatile 3 1 Typha minima 3 1 Utricularia australis 9 3 Veronica allionii 3 1 Alyssum montanum 6 2 Astragalus onobrychis 7 1 Astragalus sp. 3 1 Epipactis atrorubens 2 1 Tulipa australis 2 1 Utricularia minor 1 1 Totale Specie non più ritrovate estinte in VDA? Banca del germoplasma Specie ritrovate!!!

21 RISULTATI PROVE DNA BARCODING Estrazione DNA: 155 campioni 21 specie PCR: 155 (rbcl e matk) 79 (trnh-psba e ITS) Sequenziamento: 456 sequenze Qualità amplificazione PCR S. aethiopis: problemi di estrazione U. australis C. atrofusca C. mariscus S. ferrugineus Campioni sottoposti a PCR Esito positivo rbcl-matk~ 99% trnh-its~ 90-91% 0 rbcl matk trnh-psba ITS

22 RISULTATI PROVE DNA BARCODING Qualità sequenze rbcl-matk~ 100% Campioni sottoposti a PCR Sequenza ok ITS~ 96% trnh-its~ 76% 10 0 rbcl matk trnh-psba ITS trnh-psba: problema mononucleotide repeats

23 Efficienza discriminazione Dati preliminari matk RISULTATI PROVE DNA BARCODING E. atrorubens E. palustris rbcl E. atrorubens E. palustris NO variabilità!

24 RISULTATI PROVE DNA GENOTYPING E PROVE DI CONSERVAZIONE EX SITU Allestimento librerie genomiche Allestimento Banca del germoplasma e campionamenti

25 PROSPETTIVE RICERCHE COMPLEMENTARI E/O PARALLELE Specie selezionate DNA Barcoding campioni erbario MRSN Briofite (specie protette) Progetto tirocinio: Prove di DNA barcoding e di conservazione ex siti di Leontopodium alpinum

26 GRAZIE PER L ATTENZIONE