IL DNA è LA MOLECOLA DEPOSITARIA DELL INFORMAZIONE GENICA CHE DEVE ESSERE EREDITATA DI GENERAZIONE IN GENERAZIONE. PERTANTO LA STRUTTURA DEL DNA DEVE

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1 Duplicazione del DNA

2 IL DNA è LA MOLECOLA DEPOSITARIA DELL INFORMAZIONE GENICA CHE DEVE ESSERE EREDITATA DI GENERAZIONE IN GENERAZIONE. PERTANTO LA STRUTTURA DEL DNA DEVE ESSERE TALE DA SODDISFARE AL MEGLIO QUESTA ESSENZIALE SUA CARATTERISTICA FUNZIONALE.

3 SI INDICA CON IL VALORE C 0 t LA % DI DNA RINATURATO IN FUNZIONE DEL TEMPO E DELLA CONCENTRAZIONE. GRAZIE ALLA CURVA DI C 0 t IL GENOMA EUCARIOTICO PUO ESSERE DIVISO IN SEQUENZE ALTAMENTE RIPETUTE, MEDIAMENTE RIPETUTE, A SINGOLA COPIA

4 PARADOSSO DEL VALORE C Il paradosso del C-value (o meglio enigma del C-value) consiste nel chiedersi come ciò sia possibile. Spingendoci oltre: Il numero di cromosomi non correla con la complessità, ma neanche con la dimensione del genoma. Il numero di geni non correla con la complessità, ma neppure con la dimesione del genoma. Non sembrano esserci delle regole elementari che controllino la complessità biologica. E se non ci sono regole facilmente intellegibili a livello globale, figuriamoci scendendo nel dettaglio. I genomi presentano una notevole elasticità di dimensioni e composizione, anche tra specie apparentemente diverse.

5 IL MECCANISMO CON CUI IL DNA ASSICURA LA COSTANZA DELL INFORMAZIONE DEVE ANCHE PREVEDERE LA POSSIBILITà DI ERRORI CHE STANNO ALLA BASE DELLE VARIAZIONI ESISTENTI NEL MONDO VIVENTE UNA VOLTA CHE IL PROCESSO DI SELEZIONE LI ABBIA STABILMNETE INSERITI NEL GENOMA (V. MUTAZIONI)

6 Duplicazione - Trascrizione - Traduzione DNA Trascrizione DNA - La DUPLICAZIONE è il processo che porta alla formazione di copie delle molecole di DNA ed al trasferimento del materiale genetico RNA Traduzione - Il processo di TRASCRIZIONE è il trasferimento dell informazione dal DNA alle molecole di RNA Proteina - La TRADUZIONE è il processo mediante il quale si passa dall RNA alle proteine

7 Le cellule eucariotiche svolgono durante la loro vita una serie ordinata di eventi che costituiscono il Ciclo Cellulare Interfase comprende le fasi G 1, S, and G 2 Le macromolecole come proteine e lipidi sono sintetizzate durante la fase G 1 Il DNA è sintetizzato durante la fase S. Durante la G 2 le cellule si preparano alla divisione (M) il DNA duplicato viene suddiviso alle due cellule figlie. Le cellule che non si dividono escono dal normale ciclo ed entrano nella G 0.

8 La forma è l immagine plastica della funzione (Ruffini) POICHè OGNI FILAMENTO DETERMINA LA SEQUENZA La molecola di DNA consiste di DEL FILAMENTO COMPLEMENTARE, due catene polinucleotidiche OGNI SINGOLO FILAMENTO DELLA unite mediante le basi azotate e avvolte l una sull altra a formare MOLECOLA CHE SI APRE PUò AGIRE una doppia elica. DA STAMPO PER DIRIGERE LA SINTESI DEL NUOVO FILAMENTO. (REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA)

9 Le due catene sono antiparallele cioè i due filamenti sono orientati in direzione opposta: uno orientato in 5-3 e l altro in 3-5. Gli scheletri di zucchero fosfato si trovano all esterno della doppia elica, mentre le basi sono orientate verso l asse centrale.

10 Esperimento di Meselson e Stahl N 15 N N 14 N 14 N N 14

11 La replicazione del DNA in procarioti ed eucarioti avviene con un meccanismo semiconservativo, mediante il quale i due filamenti di DNA a doppia elica sono separati e nuovi filamenti complementari sono sintetizzati sullo stampo di ciascuna delle due eliche parentali

12 1 PACCHETTO DI ENERGIA: Idrolisi dei nucleosidi trifosfato con Liberazione di PPi e Nucleosidi monofosfati 2 PACCHETTO DI ENERGIA: Idrolisi del PPi

13 Perché il DNA subisca il processo di replicazione sono necessari: DNA polimerasi DNA stampo Precursori desossi-nucleotidi trifosfati (dntp) Altre proteine accessorie (Elicasi, Topoisomerasi, SSB etc )

14 La doppia elica si separa in due filamenti ciascuno dei quali si comporta da stampo per la sintesi di un nuovo filamento

15 Gli enzimi che catalizzano la sintesi del DNA sono chiamati DNA polimerasi

16 C si appaia con G A si appaia con T dntp Si forma un legame fosfo-diesterico

17 La direzione della sintesi è sempre 5 3 NOTA: LA DNA POLIMERASI AL CONTRARIO DELLA RNA POLIMERASI NECESSITA DI UN PRIMER PER INIZIARE LA DUPLICAZIONE

18 1 BOLLA DI REPLICAZIONE E 2 FORCELLE DI REPLICAZIONE CHE AGISCONO IN DIREZIONI OPPOSTE (ANDAMENTO BIDIREZIONALE DI SINTESI) ELICASI E PROTEINE DI SROTOLAMENTO CONTRIBUISCONO ALL APERTURA DELLA DOPPIA ELICA

19 PROBLEMA TOPOLOGICO

20 TOPOISOMERASI I RISOLVE IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E NEGATIVO (NEGLI EUCARIOTI) O SOLO NEGATIVO (NEI PROCARIOTI) OPERANDO UNA ROTTURA A SINGOLO FILAMENTO NEL DNA NON C è CONSUMO DI ATP!

21 TOPOISOMERASI II RISOLVONO IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E NEGATIVO OPERANDO UNA ROTTURA A DOPPIO FILAMENTO NEL DNA C è CONSUMO DI ATP! NEI BATTERI LA GIRASI 1 è UNA TOPOISOMERASI II CHE INTRODUCE SUPERAVVOLGIMENTI NEGATIVI PER FAVORIRE TRANSIZIONI STRUTTURALI (ES.:APERTURA DELLA DOPPIA ELICA AD INIZIO TRASCRIZIONE O DUPLICAZIONE). 1 LA DNA GIRASI DI E.coli E UN TETRAMERO COSTITUITO DA DUE SUBUNITA OGNUNA DELLE QUALI BERSAGLIO DI ANTIBIOTICI GyrA, SU CUI AGISCE L AC. NALIDIXICO (ANTIBIOTICO CHINOLONICO USATO PER INFEZIONI VIE URINARIE); GyrB, SU CUI AGISCE LA NOVOBIOCINA (VALIDO CONTRO LE INFEZIONI CAUSATE DA BATTERI COCCHI GRAM POSITIVI (ENTEROCOCCO, STRAFILOCOCCO E PNEUMOCOCCO))

22 TOPOISOMERASI I: opera il taglio a livello di uno solo dei due filamenti di DNA. TOPOISOMERASI II: I tagli avvengono a carico di entrambi i filamenti.

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24 DUPLICAZIONE NEI PROCARIOTI INIZIO L INIZIO DELLA REPLICAZIONE NEI BATTERI AVVIENE AD OPERA DEL RICONOSCIMENTO DI UNA SEQUENZA SPECIFICA DI DNA (oric) DA PARTE DELLA PROTEINA DI INIZIO dnaa. TALE INTERAZIONE DETERMINA L APERTURA DELLA DOPPIA ELICA IN UN SITO ADIACENTE RICCO IN A/T NEL QUALE INTERVENGONO LE ELICASI. QUESTE ULTIME SFRUTTANO UNA MOLECOLA DI ATP (PROCESSO ATTIVO, CON CONSUMO DI ENERGIA) PER CIASCUN GIRO DI ELICA SVOLTO.

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26 INIZIO SUCCESSIVAMENTE ALLE ELICASI AGISCONO LE PROTEINE CHE DESTABILIZZANO L ELICA (HDP: HELIX DESTABILIZING PROTEINS O SSB: SINGLE STRAND BINDING PROTEINS). TALI PROTEINE IMPEDISCONO CHE L ELICA SI RICHIUDA! LA TOPOISOMERASI II CHE AGISCE NEI BATTERI E DETTA GIRASI (E UNA TOPOISOM. DI TIPO II).

27 SSBP

28 Presenza di un PRIMER Le DNA polimerasi non sono in grado di iniziare la sintesi di un nuovo filamento, ma hanno bisogno di una estremità 3 OH libera a cui unire il nucleotide entrante Il primer è sintetizzato da una RNA polimerasi chiamata DNA primasi

29 DNA primasi Primer di RNA di 11 nucleotidi circa

30 POLIMERIZZAZIONE LE DNA POLIMERASI BATTERICHE SONO: 1) DNA POLIMERASI I; 2) DNA POLIMERASI II; 3) DNA POLIMERASI III; 4) DNA POLIMERASI IV; 5) DNA POLIMERASI V.

31 POLIMERIZZAZIONE LE DNA POLIMERASI PRINCIPALI (I, II E III) DEI BATTERI NECESSITANO DI UN INNESCO (OLIGO DI RNA) SINTETIZZATO AD OPERA DI UN ENZIMA (RNA POLIMERASI DNA-DIPENDENTE) DIPENDENTE) DETTO PRIMASI

32 LA PRIMA DNA POLIMERASI AD AGIRE è LA DNA POL III. ESSA AGIRA IN MODO CONTINUO A LIVELLO DEL FILAMENTO LEADING E DISCONTINUATIVAMENTE SUL FILAMENTO LAGGING. QUANDO IN QUESTO ULTIMO FILAMENTO LA POL III INCONTRA L INNESCO, INFATTI, INTERVENGONO LA DNA POL I O LA POL II. LA POL I HA ATTIVITA 5-3 ESONUCLEASICA! NOTA: LA DNA POL III HA ATTIVITA 3-5 ESONUCLEASICA (E IL CORRETTORE DI BOZZE) DNA polimerasi

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34 ATTIVITA 3-5 ESONUCLEASICA (CORRETTORE DI BOZZE) DELLA DNA POL III PROCESSIVITA : nt./sec. in Eucarioti; nt./sec. in Procarioti. TASSO DI ERRORE : < 1nt./10 9 nt. aggiunti

35 La sintesi in un filamento è continua nell altro è discontinua. Dove la sintesi è discontinua vengono prodotti brevi tratti di DNA chiamati frammenti di Okazaki

36 Replicazione semidiscontinua La DNA polimerasi I sostituisce l innesco di RNA con DNA

37 Azione della DNA Ligasi Si forma un legame fosfodiesterico

38 Proteine principali coinvolte nella sintesi del DNA Elicasi + DNA Primasi (PRIMOSOMA) SSBP: single strand binding proteins RNA polimerasi (DNA-dipendente) DNA polimerasi Topoisomerasi

39 SSBP Elicasi DNA polimerasi I DNA polimerasi III

40 PROCARIOTI (SCHEMA RIASSUNTIVO)

41 PROCARIOTI (SCHEMA RIASSUNTIVO) - DETTAGLIO

42 DUPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI PRINCIPALI DIFFERENZE DELL ORGANIZZAZIONE DEL DNA EUCARIOTICO RISPETTO A QUELLO PROCARIOTICO: 1) CROMOSOMI MOLTO LUNGHI (2 x 10 6 nt. IN E. coli,, CONTRO 2.5 x 109 2) PRESENZA DI NUCLEOSOMI; 3) DNA ORGANIZZATO LINEARMENTE. nt. IN H. sapiens);

43 NONOSTANTE LE MAGGIORI DIMENSIONI DEI CROMOSOMI EUCARIOTICI E LA MAGGIORE LENTEZZA CON CUI AVVIENE LA POLIMERIZZAZIONE DI NUOVO DNA NEGLI EUCARIOTI RISPETTO AI PROCARIOTI, I TEMPI DI DUPLICAZIONE DI UN INTERO GENOMA EUCARIOTICO SI AGGIRANO INTORNO ALLE 6-8 ORE. CIO GRAZIE ALL APERTURA DELL ELICA DI DNA IN PIU PUNTI CONTEMPORANEAMENTE (REPLICONI). LE DUE FORCELLE DI REPLICAZIONE DI UNA BOLLA PROCEDONO IN SENSO CENTRI= FUGO RISPETTO ALL ORIGINE DI RE= PLICAZIONE, FINO AD INCONTRARSI.

44 TUTTE LE POLIMERASI EUCARIOTICHE (AD ECCEZIONE DELLA b) ) HANNO ATTIVITà 3-5 ESONUCLEASICA!

45 INIZIO L INIZIO DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI E ASSICURATO DALLA ATTIVITA CONGIUNTA DI UN COMPLESSO PRIMASI/DNA POL a. IN QUESTO MODO VIENE POLIMERIZZATO L INNESCO ED UN PICCOLO TRATTO DI DNA. IL FATTORE DI REPLICAZIONE C (RF-C) C), INSIEME CON L ANTIGENE NUCLEARE DI PROLIFERAZIONE CELLULARE (PCNA), ATTRAVERSO UN PROCESSO ATP-DIPENDENTE, FAVORISCE LO SLOGGIAMENTO DEL PRECEDENTE COMPLESSO A FAVORE DEL LEGAME DELLA POL d, PRINCIPALE ENZIMA AGENTE SIA SULLA CATENA LEADING CHE LAGGING. QUEST ULTIMA POLIMERASI E, DUNQUE, L EQUIVALENTE DELLA POL III BATTERICA!

46 POLIMERIZZAZIONE LA RIMOZIONE DEGLI INNESCHI VIENE EFFETTUATA GRAZIE AD UNA RNasi H. LA SALDATURA DEI VARI FRAMMENTI DI OKAZAKI AVVIENE GRAZIE ALLA LIGASI!

47 IL MODELLO FINORA PIù ACCREDITATO DI RIPARTIZIONE DEGLI ISTONI DURANTE LA DUPLICAZIONE DEL DNA è QUELLO CONSERVATIVO. GLI OTTAMERI VECCHI, CIOè, CONSERVEREBBERO LA LORO IDENTITA!

48 La replicazione alle estremità dei cromosomi Cromosoma parentale Replicazione Dopo la replicazione i nuovi segmenti di DNA hanno primer di RNA all estremità interruzione 5 + interruzione 3 I primer di RNA sono rimossi, lasciando interruzioni ai telomeri 3 5

49 Telomerasi La Telomerasi è un complesso ribonucleoproteico costituito dalla trascrittasi inversa (componente proteica) [TERT: Telomerase Reverse Transcriptase)] e da un RNA stampo [TERC: Telomerase RNA Component] Aggiunge ripetizioni telomeriche alle estremità dei cromosomi, prevenendo la perdita dei telomeri dovuta ai continui cicli di replicazione

50 La replicazione alle estremità dei cromosomi a

51 LA TELOMERASI E ASSENTE NELLE CELLULE SOMATICHE, E PRESENTE NELLE CELLULE GERMINALI, SI RIATTIVA NELLE CELLULE CANCEROSE (STAMINALI DEL CANCRO). IL NUMERO DI DIVISIONI DI UNA CELLULA NORMALE DIPANDE DALLA LUNGHEZZA DEI TELOMERI.