Spettrometria di Massa applicata alla PROTEOMICA
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- Floriana Pini
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1 Spettrometria di Massa applicata alla PROTEOMICA 1. MALDI-TOF: Determinazione di mappe peptidiche mediante digestione in gel di spot separati su E-2D E da estratti proteici totali Identificazione rapida di proteine a partire da tale mappa peptidica ( (PeptidePeptide Mass Fingerprinting) 2. Nanospray o HPLC-ESI associato a TQ o IT: CID: frammentazione di peptidi selezionati Identificzione di proteine attraverso gli spettri di frammentazione di tali peptidi (sequenza amminoacidica)
2 Identificazione di proteine attraverso peptide mass finger print Three main groups: Algoritmi e Programmi - programs using proteolytic peptide fingerprint for protein identification (PeptIdent, MultiIdent, ProFound); - programs additionally operating with MS/MS spectra (PepSea, MASCOT, MS-Fit, MOWSE) or with MS/MS only; - programs operating with MS/MS only (SEQUEST, PepFrag, MS-Tag, Sherpa).
3 Databases disponibili per l identidicazione di proteine SWISS-PROT is a database of annotated protein sequences; it also contains additional information on function of the protein, its domain structure, posttranslational modification(s), etc.; - TrEMBL is a supplement to SWISS-PROT, which contains all protein sequences, translated from nucleotide sequences of the EMBL database; - PIR-International (Protein Identification Resource, National Biomedical Research Foundation, Washington, USA) is also an annotated database of protein sequences; - NCBInr (National Center of Biotechnological Information) is a database containing sequences translated from DNA sequences of GenBank and also sequences from PDB, SWISS-PROT, and PIR databases; - ESTdb (Expressed Sequence Tags database, NCBI, NIH). - programs operating with MS/MS only (SEQUEST, PepFrag, MS-Tag, Sherpa).
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9 ANALISI DEI PESI MOLECOLARI DEI PEPTIDI OTTENUTI PER DIGESTIONE SPECIFICA DI UNA PROTEINA L identificazione di una proteina dipende dai seguenti parametri: Accuratezza nella determinazione della massa dei frammenti Numero delle masse sottomesse per l interrogazione del database Distribuzione delle masse Numero delle masse che sono in accordo fra quelle sperimentali e quelle teoriche per la proteina del database Dimensione del database di sequenze proteiche Numero delle modificazioni a carico della proteina considerate
10 Effetto dell errore di massa sul matching di peptidi a) mass error = 0.5 Da b) Mass error = 0.35 Da c) mass error = 0.2 Da d) mass error = 0.1 Da e) mass error = 0.05 Da f) mass error = 0.01 Da
11 RIASSUMENDO una volta effettuata la 2D-PAGE (compresa analisi dell immagine): Prelevare lo spot e sottoporlo a trattamento proteolitico specifico Analizzare mediante MS la miscela di peptidi ottenuti SPETTRO DI MASSA PEAK LIST Eseguire una ricerca su banche dati di sequenze proteiche con la lista dei pesi molecolari determinati con la spettrometria di massa Nel caso di mancata identificazione: Selezionare eventuali peptidi da sequenziare (il p.m. del peptide deve essere < 2.5 kda) N.B. Una sequenza corretta di 5-65 residui amminoacidici può essere sufficiente per l identificazione di una proteina
12 L identificazione viene raggiunta soltanto nel caso in cui una sequenza con un Peptide Mass Fingerprint (PMF) corrispondente a quello ottenuto sperimentalmente sia nota. Questo metodo di identificazione è particolarmente efficiente quando il genoma dell organismo, e quindi le sequenze amminoacidiche delle proteine da esso derivanti, è conosciuto. N.B. non c è alcuna determinazione strutturale diretta della sequenza amminoacidica
13 Procedura usata per ricerca in database di proteine Si forniscono al motore di ricerca i risultati ottenuti con lo spettro s di massa (PMF) e informazioni generiche: - peso molecolare della proteina - Punto isoelettrico - Eventuali modificazioni note - Banca dati su cui effettuare la ricerca - Mass error - Enzima proteolitico usato Il motore di ricerca seleziona fra le proteine presenti in banche dati quelle compatibili con le informazioni ed i parametri di ricerca forniti. Si ripete la ricerca nel caso in cui i risultati non siano statisticamernte validi. Si possono eventualmente modificare i parametri di ricerca. Si procede all analisi analisi della/e proteina/e con lo score più alto. Si valuta la presenza di eventuali modificazioni che potrebbero aver prodotto variazioni del PM di peptidi non trovati e si esegue un analisi inversa sullo spettro di massa.
14 Come incrementare la specificità della ricerca Informazioni aggiuntive Sequenza amminoacidica di almeno un peptide (MS/MS o Degradazione di EdmanE dman) Amminoacido N-terminale Composizione amminoacidica della proteina Western Blot ed immunorivelazione specifica
15 Ricerca MASCOT dati MS/MS L identificazione di una proteina viene fatta su database di sequenze proteiche, sia attraverso il suo fingerprint (spettro di massa di un digerito proteolitico) sia attraverso la sequenza di peptidi selezionati. Le masse osservate negli spettri di massa acquisiti vengono comparate con quelle teoriche; ad ognuna viene attribuito un punteggio (score). Gli score attribuiti ad ogni peptide vengono combinati in modo da ottenere uno score per l intera proteina.
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23 Analisi quali-quantitativa quantitativa degli amminoacidi Gli attuali metodi a disposizione per questo tipo di analisi comportano tre passaggi fondamentali: Idrolisi della proteina con liberazione degli amminoacidi che la l costituiscono. Separazione degli amminoacidi presenti nell'idrolizzato. Quantificazione dei diversi amminoacidi. 1) IDROLISI Condizioni: HCl 6N, 110 C, 24 h.
24 2) Separazione e quantificazione degli amminoacidi presenti nell'idrolizzato: Solubilizzazione aa in tampone a ph 2 (tutti carichi positivamente) Separazione cromatografica degli amminoacidi e loro quantificazione. (es. polistireni solfonati: : scambiatori cationici forti) Eluizione: : gradiente di forza ionica e di ph. Rivelazione post-colonna (es. ninidrina; ; OPA). L'assorbanza o la fluorescenza di ciascun picco è proporzionale alla concentrazione dell'amminoacido.
25 Degradazione di Edman Fenilisotiocianoato H O N C S + H 2 N C C CH 3 Labeling Asp Phe Phe Arg C O O - Su peptidi isolati! H N S C H N H O C C CH 3 Asp Phe Phe Arg C O O - S N N H O PTH-alanine CH 3 Release O + H 2 N Asp Phe Phe Arg C O - Peptide shorthened by one residue In condizioni alcaline, il fenilisotiocianato (PTC) reagisce con i residui N-terminali di proteine/peptidi. Il residuo aminoterminale, derivatizzato con un marcatore identificabile, viene rilasciato e rivelato. Il peptide restante rimane intatto.
26 Serie di reazioni eseguita automaticamente in: SEQUENZIATORI AUTOMATICI DI PROTEINE. Teoricamente si possono identificare fino a 60 residui della porzione N- terminale della proteina; l'identificazione degli amminoacidi rilasciati nei cicli successivi diventa problematica, a causa degli effetti cumulativi di reazioni incomplete e di reazioni secondarie del processo di degradazione. Questi apparecchi permettono di poter lavorare con quantità molto basse di proteina: nell'ordine di decine di pmoli.
27 Sequenziamento di peptidi con MALDI-TOF
28 Sequenziamento di peptidi con MALDI-TOF
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