MICROPROPAGAZIONE: PICCOLE PIANTE IN VITRO.

Transcript

1 MICROPROPAGAZIONE: PICCOLE PIANTE IN VITRO. Introduzione: Che cos è la Micropropagazione? La Micropropagazione è una tecnica che consente di mantenere e propagare artificialmente cellule o interi organismi viventi appartenenti al regno dei vegetali. La tecnica della micropropagazione o coltura in vitro rappresenta, da più di trent anni, il metodo di propagazione più efficiente nella produzione di piante in vivaio. Rispetto ad altre tecniche di propagazione convenzionali, la micropropagazione riesce a produrre in breve tempo un maggior numero di piante, geneticamente uniformi ed esenti da virus. Quando si parla di coltura in vitro si intende la produzione di piante, a partire da piccolissime parti delle medesime, tessuti o cellule allevate in ambiente asettico (provette o altri contenitori), ove si possono controllare sia i fattori ambientali che nutrizionali. I vantaggi principali della micropropagazione possono essere cosi riassunti: 1. produzione di un gran numero di piante,utilizzando anche solo una pianta madre, con un notevole risparmio nel mantenimento delle stesse; 2. garantire l uniformità genetica delle nuove piante rispetto alla pianta madre; 3. ottenimento di un gran numero piantine in uno spazio ristretto; 4. riprodurre piante virus esenti; 5. può costituire un utile strumento per la conservazione del germoplasma di una specie, cioè di quei genotipi che per vari motivi non sono più utilizzati, ma depositari di caratteri genetici molto importanti. Invece di essere raccolti in costose collezioni di pieno campo possono essere conservate in vitro ed in uno spazio piccolo; 6. possibilità di propagare specie a basso potenziale rizogeno e quindi difficilmente moltiplicabili con le tecniche più tradizionali (talea, propaggine, margotta). Gli svantaggi derivanti dalla propagazione in vitro sono rappresentati essenzialmente: 1. a livello industriale: alti costi per le attrezzature richieste. 2. richiesta di personale qualificato e specializzato vista l esigenza di lavorare in ambiente asettico e controllato 3. diffusione di patogeni che se non sono subito individuati possono causare problemi 1

2 molto seri (rischio presente anche con le tecniche tradizionali) Micropropagazione: piccole piante in vitro Il substrato di crescita. La preparazione del substrato di crescita riveste un importanza fondamentale in ogni fase in vitro del ciclo di propagazione. Per ogni specie e per ogni fase della coltura in vitro, infatti, vi è uno specifico substrato. La scelta degli elementi che devono far parte del substrato deve essere accurata sia nel tipo che nella concentrazione. Per le specie gia conosciute esistono delle formulazioni che portano il nome dei loro scopritori, il più noto dei quali è il Murashige & Skoog (1962) (M&S), mentre per le nuove specie che devono essere micropropagate, si deve procedere empiricamente e mettere a punto un substrato adatto. Ogni substrato è composto da due parti fondamentali: la componente minerale; la componente organica; La componente minerale La componente minerale è costituita da: macroelementi: rappresentano i principali elementi indispensabili per la crescita delle piante e sono azoto, fosforo, potassio, calcio, magnesio, e zolfo. Le formulazioni con cui si possono utilizzare e le concentrazioni variano tra i vari substrati e dipendono dalla specie utilizzata. microelementi: sono presenti nei substrati in piccole quantità, sono metalli, e hanno notevole importanza poiché svolgono un ruolo essenziale nei vari processi metabolici e fisiologici della pianta. I microelementi principali utilizzati per la micropropagazione sono ferro manganese, zinco, boro, rame, cobalto e molibdeno. Il ferro viene somministrato in forma di chelato (FeEDTA). La componente organica. La componente organica è rappresentata essenzialmente da: Carboidrati. In vitro i germogli non riescono ad espletare la normale attività di fotosintesi sia perché gli scambi gassosi sono ridotti per la presenza del tappo che riveste il contenitore, quindi non riescono ad avere la giusta quantità di CO 2, sia perchè 2

3 l intensità luminosa della camera di crescita è molto bassa. Di conseguenza per ovviare ad una insufficiente attività fotosintetica, si rende indispensabile l'aggiunta al substrato di crescita del saccarosio, come sorgente energetica. L elevata presenza di zucchero riveste inoltre una notevole importanza anche nella regolazione del potenziale osmotico del mezzo di coltura, condizionando l assimilazione dell acqua e degli elementi nutritivi ed influenzando indirettamente la capacità di crescita dei tessuti. La presenza di zucchero nel mezzo di coltura, può essere rischioso da un punto di vista fitosanitario, creando un ambiente adatto per lo sviluppo di funghi e batteri. Vitamine. Svolgono, quando presenti, una funzione di cofattore della crescita entrando a far parte di diverse attività cellulari. Le più utilizzate sono tiamina, mio inositolo e biotina, acido nicotinico e piridossina. Regolatori di crescita. La presenza dei regolatori della crescita è il fattore che caratterizza la diverse fasi del ciclo di propagazione. Sebbene nelle piante gli ormoni non abbiano un azione specifica, considerato che uno stesso effetto potrebbe essere stimolato da ormoni diversi, in alcune fasi la presenza di alcuni di essi influisce in maniera marcata sul tipo di risposta dei germogli. Nella micropropagazione gli ormoni più utilizzati sono auxina, citochinina, gibberellina. Oltre agli effetti prodotti dalla concentrazione dei singoli ormoni bisogna considerare il bilancio ormonale, cioè il rapporto tra le concentrazioni dei vari ormoni che in base alla fase in cui si opera, deve essere sbilanciato verso un tipo di ormone rispetto ad un altro, in relazione alle risposte che si desiderano. La concentrazione e le combinazioni in cui vengono utilizzati variano notevolmente in funzione della specie vegetale. Agar. Un altra importante componente organicadel substarto di coltura è l agar che conferisce allo stesso una consistenza gelatinosa; in questo modo è possibile mantenere i germogli in posizione eretta; questi viene aggiunto al substrato prima dell autoclavazione. L'unico svantaggio nell'utilizzo dell'agar è che rallenta la diffusione dei nutrienti all interno del substrato, quindi i germogli possono assorbire solo gli elementi presenti intorno alla loro base. Per questo motivo il rinnovo del substrato si rende necessario e frequente. 3

4 Il nostro lavoro. Materiale utilizzato. Per la realizzazione del lavoro sono stati utilizzati bisturi, pinzette, Piastre Petri in plastica, contenitori di varia fattura e dimensioni in vetro, vetrino da orologio, parafilm, Becco Bunsen, Pentola a Pressione, guanti. Tutto il materiale utilizzato è stato sottoposto a sterilizzazione, in pentola a pressione per 30'. il materiale che non era possibile sterilizzare (termolabile) è stato trattato con soluzioni di alcool al 70% e candeggina. Il terreno su cui sono cresciute le piante è stato preparato utilizzando una miscela di sali e vitamine detto MS e presente in commercio. Alla miscela di sali è stato aggiunto un volume di acqua distillata seguendo le indicazioni del produttore, saccarosio (30 g/l) e ormoni di crescita (Auxina e citochina). 4

5 Per gli ormoni sono state provate varie concentrazioni e rapporti al fine di trovare la combinazione ottimale per ciascuna pianta utilizzata. Sterilizzazione. Tutto il lavoro è stato condotto cercando di mantenere i luoghi, gli oggetti e l'ambiente in cui lavoravamo, quanto più possibili pulito e idealmene sterile, in quanto ogni più piccola contaminazione avrebbe rovinato l intera coltura. Gli strumenti usati che potevano essere esposti alla fiamma (bisturi, pinzette..) venivano passati alla fiamma sul becco bunsen, per eliminare la gran parte dei possibili contaminanti biologici presenti sull oggetto. Tutte le operazioni sono state svolte nell'ambiente confinato della cappa in presenza del bunsen acceso. In alternativa alla fiamma, abbiamo utilizzato la pentola a pressione, per la maggior parte del materiale o soluzioni di alcool e di candeggina. Tempo. Tra un impianto e l'altro, abbiamo dovuto attendere circa un mese affinchè i germogli avessero il tempo di formarsi e crescere. Le piantine sono state poste a crescere in una camera di crescita autocostruita, utilizzando una piastra termostatata per l'allevamento dei rettili e una sorgente luminosa. La temperatura della camera di crescita è stata impostata sui 25 C mentre per la luce si è impostato un fotoperiodo di 16 ore. Procedimento seguito: 1. Abbiamo reperito del materiale (tralci di piante rampicanti, foglie, gemme ascellari ecc.) apartenenti a piante diverse. 2. Utilizzando un bisturi, precedentemente sterilizzato, abbiamo tagliato parti di foglie assicurandoci la presenza di nervature o gemme o porzioni di tralci contenenti gemme. 3. Abbiamo messo i campioni prelevati in un contenitore con candeggina diluita (diluizione al 20% di candeggina commerciale) per circa 5'; al termine dei 5' i 5

6 campioni sono stati sciacquat con acqua distillata sterile e trasferiti in contenitori con una soluzione di alcool 70% per altri 5 minuti. 4. Dopo averli risciaquati con acqua distillata, abbiamo tolto i margini che avevano raggiunto un colore biancastro a causa dell'azione della candeggina e dell'alcool (tessuti danneggiati) e con l'aiuto di una pinzetta abbiamo posto la parte rimasta in una Piastra Petri contenente il terreno di crescita. 5. Le piastre Petri sono state poi chiuse e sigillate con il Parafilm prima di porli nella camera di crescita. Risultati del lavoro: Nella maggior parte dei casi i campioni messi in coltura hanno sviluppato dopo poco tempo muffe, e colonie batterihe che hanno sopraffatto la piantina impedendole di crescere. Alcuni campioni però sono riuscite a svilupparsi e abbiamo quindi potuto osservare lo sviluppo di una piantine. Considerazioni e commenti Grazie a quest'esperienza abbiamo potuto valutare da vicino tutti i requisiti neccessari alla crescita si una pianta; inoltre, dovendo lavorare in un ambiente il più possibile sterile, ci siamo resi conto di come i microrganismi ci circondino in ogni momento e in ogni luogo e come sia estremamente difficile, per non dire impossibile, riuscire ad evitare completamente contaminazioni da microrganismi. Pur utlizzando materiale pulito/sterilizzato e utilizzando tutte le accortezze possibili per mantenere la sterilità in molti casi le contaminazioni si sono presentate ugualmente; questo ultimo fenomeno ci ha fatto riflettere molto su i comportamenti di natura igienicosanitaria che normalmente abbiamo e di cui non ci rendiamo conto. 6

7 L'ESPERIMENTO PROPOSTO. Data la complessità del lavoro, non potendo far provare ai visitatori direttamente quello che abbiamo fatto nel corso dei mesi a scuola. Abbiamo predisposto un percorso che consentirà di simulare il procedimento e i risultati che si possono ottenere. 7