Solida. una fase fissa (o stazionaria) Liquida. una fase mobile che la attraversa con un flusso continuo e provoca la migrazione dei soluti.

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1 TECNICHE CROMATOGRAFICHE insieme di tecniche che permettono di separare i soluti contenuti in un miscuglio omogeneo in base alla loro diversa distribuzione fra due fasi immiscibili: una fase fissa (o stazionaria) Solida Liquida una fase mobile che la attraversa con un flusso continuo e provoca la migrazione dei soluti Liquida Gassosa Una sostanza si ripartisce tra le due fasi a seconda della sua diversa affinità per l una o per l altra.

2 Riferendosi ad una specifica tecnica cromatografica, si indicano entrambe le fasi, citando per prima la fase mobile Di adsorbimento Liquido solido gas - liquido Di ripartizione A scambio ionico Per filtrazione molecolare Di affinità Liquido liquido gas - liquido Liquido solido Liquido solido Liquido solido

3 In relazione al diverso supporto per la fase fissa, la cromatografia si distingue in Cromatografia su colonna La fase stazionaria, come tale o attaccata ad una matrice insolubile, è impaccata in una colonna. La fase mobile passa nella colonna per gravità o applicando pressione. Cromatografia planare su strato sottile: la fase stazionaria solida viene stratificata su vetro, metallo o plastica su carta: la fase stazionaria liquida si lega alle fibre di cellulosa La fase mobile attraversa la fase fissa per capillarità

4 Durante l eluizione, in ogni punto del supporto, la sostanza è coinvolta in un processo dinamico di trasferimento dalla fase stazionaria a quella mobile e viceversa Si avrà un meccanismo di estrazione-trascinamento-estrazione. reversibile : ogni componente della miscela tende a distribuirsi tra le due fasi passando attraverso una serie infinita di stati di equilibrio che si realizzano in ogni strato di spessore infinitesimale della fase stazionaria

5 La distribuzione dei composti fra la fase fissa e la fase mobile può avvenire in base a principi diversi: Adsorbimento cromatografia di adsorbimento Ripartizione cromatografia di ripartizione Dimensioni molecolari cromatografia per filtrazione molecolare Carica elettrica cromatografia a scambio ionico Affinità di legame cromatografia di affinità

6 Si definisce COEFFICIENTE DI DISTRIBUZIONE, Kd, il rapporto all equilibrio tra la concentrazione C A di quella sostanza nella fase A e la concentrazione C B nella fase B Kd = C A C B = Concentrazione nella fase A Concentrazione nella fase B se la sostanza è egualmente solubile nelle due fasi, Kd è uguale a 1 se è più solubile nella fase A Kd sarà > 1 se è più solubile nella fase B Kd sarà < 1 Kd è costante per un dato soluto, ad una determinata temperatura, e dipende solo dai solventi usati

7 Zone A, B, C, D, E hanno altezza = 1 cm fase fissa = materiale solido granulare volume fase mobile = 1 ml per ogni zona Ogni ml di solvente aggiunto sposta un volume corrispondente nella zona sottostante e provoca l uscita dalla colonna di 1 ml di liquido.

8 Esempio: campione X con c = 32 mg/ml Kd = 1 (stadio 1) Distribuzione dei 32 mg di X nelle due fasi: 16 mg nella fase fissa della zona A e 16 mg nella fase mobile (stadio 2) L aggiunta di 1 ml di solvente provoca lo spostamento del solvente (con la quantità totale di X in esso contenuta = 16 mg) nella zona B. In A e in B X è distribuito nelle due fasi: 8 mg nella fase fissa e 8 mg nella fase mobile (stadio 3, 4 e 5) Si aggiunge ogni volta 1 ml distribuendo il composto X lungo la colonna. X è sempre contenuto metà nella fase fissa e metà nel solvente.

9 Conc. soluto

10 Se i componenti di una miscela hanno un diverso coefficiente di distribuzione Kd si ripartiscono in maniera diversa tra la fase fissa e la fase mobile I vari componenti si separano in bande di migrazione e potranno essere eluiti separatamente, e quindi analizzati D A B C conc Volume eluito

11 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO E una cromatografia liquido solido, su colonna o su strato sottile Principio della separazione Alcuni materiaii solidi hanno la proprietà di trattenere molecole sulla loro superficie tramite la formazione di legami deboli (Forze di Van Der Waals, legami idrogeno)

12 Prima cromatografia 1906

13 Ca(OH) 2 I soluti vengono eluiti utilizzando solventi che abbiano le stesse caratteristiche di polarità

14 Eluenti Bassa polarità Esano Eptano Toluene Acetonitrile Etere etilico Cloroformio Media polarità Acido acetico Diclorometano Piridina Alta polarità H O 2 1- P ropanolo 1- B utanolo Etanolo Metanolo

15 E una cromatografia liquido liquido Principio della separazione: Diversa solubilità delle sostanze in un sistema di solventi non miscibili e con polarità diverse In genere si ha: fase fissa: polare fase mobile: più apolare della fase fissa e con questo tipo di polarità la cromatografia viene definita CROMATROGRAFIA IN FASE NORMALE Può essere effettuata su: carta, strato sottile, colonna

16 La cromatografia di ripartizione su carta può essere ascendente o discendente a seconda della direzione del solvente nel percorrere la carta

17 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE O TLC Supporto: lastrina di metallo, vetro o plastica in strato sottile (0,25 2 mm) di materiale adatto: gel di silice, agarosio, poliammide,ecc. Fase mobile: solvente organico Su strato sottile, a seconda del tipo di supporto usato, è possibile effettuare, oltre la cromatografia di Ripartizione, anche cromatografia di Adsorbimento e per Filtrazione Molecolare

18 Per l identificazione dei composti si calcola Rf = rapporto rispetto al fronte del solvente

19 Rf = rapporto rispetto al fronte del solvente Fronte del solvente apolare distanze percorse dai composti A e B e dal fronte del solvente A B df da db deposizione del campione Rf A = da df Rf B = db df 1 Rf 0 Rf = 1 sostanza solubile nel solvente apolare Rf = 0 sostanza solubile in H 2 O

20 CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE su strato sottile sostanze che hanno lo stesso Rf in un solvente possono essere separate con un seconda corsa in un solvente diverso fatto scorrere in direzione ortogonale

21 Principio della separazione: dimensioni delle molecole E una cromatografia liquido solido che si può effettuare su colonna e su strato sottile Fase stazionaria materiale poroso costituito di polimeri a struttura tridimensionale reticolata che in H 2 O si rigonfia formando un gel che funziona da setaccio molecolare. Destrano polimero del glucosio con legami α (1->6) Agarosio polimero del galattosio con legami β (1->4) Poliacrilammide copolimero della acrilammide e della bisacrilamide

22 V t = V 0 + V i V t = Volume totale V i = Volume incluso V 0 = Volume escluso Le molecole più grandi percorrono solo il volume escluso, quindi viaggiano più velocemente e vengono eluite prima. Le molecole più piccole percorrono il volume totale e vengono eluite dopo.

23 Applicazioni della gel filtrazione Separazione di proteine e acidi nucleici a scopo preparativo. Desalificazione di una soluzione proteica. Determinazione del peso molecolare il volume escluso è una funzione lineare del logaritmo del peso molecolare

24 La fase fissa è una resina costituita da polielettroliti insolubili che dissociano in uno ione fisso che rimane legato alla matrice e un controione di segno opposto a quello dei gruppi legati I contro-ioni possono scambiarsi con qualsiasi ione dello stesso segno presente in soluzione

25 Scambiatori cationici: Ione fisso negativo Resine acide Es: R-SO 3 - H + Controione positivo Scambiatori anionici: Ione fisso positivo Resine basiche Es: R- N + (CH 3 ) 3 OH - Controione negativo Per una resina solfonica lo scambio ionico può essere così schematizzato: R - SO 3 - H + + Na + R -SO 3 - Na + + H +

26 Scambiatori forti -SO 3 H Resine solfoniche -N(CH 3 ) 3 OH Resine trimetilaminiche Scambiatori deboli -COOH Carbossimetilcellulosa (CMC) -N(CH 2 CH 3 ) 3 OH Dietilaminoeticellulosa (DE-cellulosa)

27 Applicazioni della cromatografia a scambio ionico Separazione di polielettroliti macromolecolari a scopo preparativo: proteine e acidi nucleici Separazione di miscele di aminoacidi per analisi qualitative e quantitative Preparazione di acqua deionizzata

28 Preparazione di acqua deionizzata Deionizzatori : Colonne a letto misto Resina acida: + R SO3 H + Na + Cl - R SO Na HCl Resina basica: + - R N CH OH + + ( 3 ) HCl R N ( CH 3 ) Cl + H 2O 3 3

29 Aminoacidi = elettroliti anfoteri R + CH - N H 3 COO - R Anfione ph = P.I. R CH - N + H 3 COOH CH - NH 2 COO - Catione ph < P.I. Anione ph > P.I.

30 R R R -SO - 3 Na + + CHNH + 3 R - SO - 3 CHNH Na + COOH COOH

31 Comportamento di una resina a scambio cationico nei confronti di un aminoacido carico positivamente e di uno carico negativamente Posso separare una miscela di aminoacidi in base alla loro differenza di P.I. Gli aminoacidi possono essere separati sia con una resina a scambio cationico che con una resina a scambio anionico

32 FASI DEL MECCANISMO DI SCAMBIO IONICO 1) Caricamento del campione 2) Spiazzamento dello ione al sito di scambio 3) Diffusione del controione attraverso la resina 4) Lavaggio 5) Eluizione selettiva distacco selettivo ad opera di un eluente con diverso ph o forza ionica 6) Rigenerazione della resina con ripristino dei controioni

33 Analizzatore di Aminoacidi

34 Reazione della ninidrina O O H O H O NINIDRINA + R CH NH 2 COOH O H O H O IDRINDANTINA + R CHO ALDEIDE + CO + NH 2 3 O O H O H O NINIDRINA + + NH 3 O H H O O IDRINDANTINA O C H O N C + 3 H O 2 O porpora di Ruheman Max assorbimento = 570 nm per tutti gli aminoacidi = 440 nm per prolina e idrossiprolina O

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36 E una cromatografia liquido solido Il principio su cui si fonda è la reazione reversibile tra M, una macromolecola, generalmente una proteina,ed un ligando specifico L, M + L Complesso ML Il ligando - che può essere un substrato o un inibitore competitivo o un coenzima se la proteina da separare è un enzima - viene immobilizzato su una matrice insolubile di agaroso o poliacrilammide, polistirene, cellulosa, silice, e costituisce la fase fissa che viene impaccata in una colonna. Questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per la purificazione degli enzimi, ma, in seguito, è stata anche applicata ai nucleotidi, agli acidi nucleici, alle immunoglobuline, ai recettori di membrana, a cellule o a frazioni subcellulari.

37 A B C D Ligando immobilizzato Proteina da isolare Proteine diverse Ligando per la eluizione Complesso proteina - ligando A = la soluzione in esame viene caricata su una colonna nella quale un ligando specifico è immobilizzato sulla fase fissa. La proteina ricercata reagisce con il ligando e resta fissata sulla colonna B = la colonna viene lavata con un tampone e vengono allontanate le proteine che non hanno affinità per il ligando C = si fa percolare sulla colonna una soluzione contenente un ligando diverso da quello immobilizzato e per il quale la proteina ricercata abbia una affinità maggiore. D = la proteina reagisce con il nuovo ligando e il complesso proteina-ligando viene eluito. L eluato viene poi dializzato per allontanare il ligando

38 Con il termine high pressure liquid chromatography, HPLC, (ma anche high performance liquid chromatography), o cromatografia ad alta risoluzione, si definiscono quelle metodiche di cromatografia liquido-liquido o liquido-solido che utilizzano colonne di diametro molto piccolo, materiali di supporto a particelle molto fini, ed elevate pressioni per mantenere sufficiente velocità di flusso della fase mobile. Poiché la separazione cromatografica tra fase fissa e fase mobile è un fenomeno di superficie, l uso di particelle molto piccole, aumentando l area superficiale disponibile, permette di ottenere in tempi brevi una separazione ottimale delle sostanze in esame. COLONNE in acciaio inossidabile, con diametro interno da 2 a 9 mm e lunghezza di 3-30 cm, che sopportare pressioni fino a 300 atm.

39 In HPLC possono essere sfruttati praticamente tutti i diversi principi che sono alla base dei diversi metodi di cromatografia liquido-solido o liquido-liquido: cromatografia di adsorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare, di affinità. E inoltre possibile effettuare, oltre alle cromatografia in Fase Normale, anche CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA Fase fissa: apolare Fase mobile: più polare della fase fissa Nella HPLC in fase inversa la fase stazionaria è un idrocarburo inerte e le interazioni con il soluto sono unicamente di tipo idrofobico.

40 Le fasi stazionarie più comunemente usate sono costituite da molecole di n-butano, n-ottano, n-octadecano unite con legame covalente su un supporto di particelle sferiche di silice, di diametro inferiore a 25 µm; queste fasi vengono indicate semplicemente come C4,C8 e C18.. La fase mobile è generalmente una soluzione acquosa, addizionata di un solvente organico: i primi composti ad essere eluiti saranno quelli più polari e successivamente quelli meno polari

41 Rappresentazione schematica di un apparecchiatura per HPLC S, S1 solventi per l eluizione P = pompa CM = camera di mescolamento I = iniettore S = siringa C = colonna R = sistema di analisi dell effluente collegato ad un sistema di elaborazione dati e di registrazione, RG PC = precolonna

42 Permette la separazione di sostanze volatili o che possono essere vaporizzate senza essere decomposte. Vantaggi: Rapidità e riproducibilità delle analisi Elevata sensibilità (1pg di sostanza)

43 Fase stazionaria Gas liquido (GLC) o Liquido a bassa tensione di vapore (elevata temperatura di ebollizione): oli di silicone squalene, poliglicoli poliesteri, cere Cromatografia di ripartizione gas solido (GSC) gel di silice allumina carbone vegetale Cromatografia di adsorbimento Fase mobile: Eluente: He N 2 H 2 Sostanze analizzate: Idrocarburi Alcoli Aldeidi Acidi grassi (esteri metilici) Steroidi come tali (quelle apolari) o derivatizzate (quelle polari)

44 Colonna: contenitore di metallo di 0,5 1 cm di diametro e 2 3 metri di lunghezza a forma di spirale.