Corso di. Proteomica e bioinformatica. modulo: Biochimica delle proteine

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1 Corso di Proteomica e bioinformatica modulo: Biochimica delle proteine Dott. Stefano Toppo Dipartimento di Chimica Biologica (Vallisneri piano terra stanza 85) Viale G. Colombo, Padova. Tel.: Fax.: stefano.toppo@unipd.it Home-page:

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3 Pietre miliari Le proteine supportano ogni reazione che avviene in un sistema biologico Le proteine compongono il 50% del peso secco della cellula; sono presenti in percentuali molto maggiori a quelle delle altre macromolecole cellulari Ca Johannes Mulder e Jakob Berzelius ( C, N, O, H in gelatina, albumina,...). Proteus... -> proteine Almeno 40 Premi Nobel per la Chimica o per Biologia e Medicina sono stati assegnati in relazione a studi su proteine

4 Funzioni delle proteine: Riconoscimento Catalisi Switch Funzionali Struttura

5 Alcune Funzioni delle Proteine Enzimi/catalizzatori Proteine contrattili o strutturali Proteine di trasporto Effettori Proteine di difesa Proteine per il trasporto elettronico Recettori Repressori Chaperoni Proteine di deposito TRIPSINA ACTINA Hb INSULINA Ab Cyt OXID CD4 Jun GroEl FERRITINA

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8 La struttura delle proteine e descritta da quattro livelli di organizzazione Struttura Primaria- la sequenza di aminoacidi Struttura Secondaria - strutture locali stabilizzate da legami H che coinvolgono lo scheletro peptidico (cioe i gruppi carbonilici e aminici) e che si estendono in una dimensione Struttura Terziaria - Descrive i ripiegamenti che permettono alle proteine di assumere una struttura tridimensionale. Stabilizzata da tutti i tipi di interazioni deboli che coinvolgono le catene laterali degli aminoacidi. I ponti disolfuro, se presenti, hanno un ruolo nella stabilizzazione di questa struttura. Struttura Quaternaria - organizzazione in subunita

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10 Il codice genetico

11 Il codice genetico Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAG, UGA, UAA Start/stop codons 1. The most common start codon is AUG, which codes for methionine, so most amino acid chains start with methionine. 2. The three stop codons have been given names: UAG is amber, UGA is opal (sometimes also called umber), and UAA is ochre. "Amber" was named by discoverers Richard Epstein and Charles Steinberg after their friend Harris Bernstein, whose last name means "amber" in German. The other two stop codons were named 'ochre" and "opal" in order to keep the "color names" theme.

12 Il codice genetico Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAG, UGA, UAA 1. Un codone è detto quattro volte degenere se qualsiasi nucleotide nella sua terza posizione codifica lo stesso amminoacido (ad esempio, UCA, UCC, UCG e UCU, tutti corrispondenti alla serina); 2. è detto due volte degenere se solo due delle quattro basi nella sua terza posizione codificano lo stesso amminoacido (ad esempio AAA ed AAG, corrispondenti alla lisina). Nei codoni due volte degeneri, i nucleotidi equivalenti nella terza posizione sono sempre o due purine (A / G) o due pirimidine (C / U).

13 Il codice genetico Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAG, UGA, UAA 1. La ridondanza rende il codice genetico meno vulnerabile alle mutazioni causali. Un codone quattro volte ridondante può subire qualsiasi mutazione alla sua terza posizione ed un codone due volte ridondante può subire una delle tre possibili mutazioni alla sua terza posizione senza che l'amminoacido da esso espresso - e quindi la struttura della proteina in cui l'amminoacido verrà inserito - cambi. Inoltre, dato che le mutazioni per transizione (da una purina all'altra o da una pirimidina all'altra) sono più probabili delle mutazioni per transversione (da purina a pirimidina o viceversa), l'equivalenza tra purine o tra pirimidine nei codoni due volte degeneri aggiunge un'ulteriore resistenza.

14 Il codice genetico Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAG, UGA, UAA Diverse variazioni al codice genetico standard sono state trovate nei mitocondri. Anche i protozoi ciliati presentano qualche modifica: in loro (come anche in alcune specie di alga verde) UAG e, spesso, UAA codificano la glutammina e UGA codifica la cisteina. In alcune specie di lievito CUG codifica la serina. codici genetici A dispetto di queste variazioni, i codici genetici usati da tutte le forme di vita della Terra sono molto simili. Dato che i codici genetici possibili e potenzialmente adatti alla vita sono molti, la teoria dell'evoluzione fa pensare che questo codice genetico sia andato a definirsi molto presto nella storia della vita su questo pianeta. Le pressioni che poi possono aver portato all'evoluzione di codici genetici non canonici sono state sicuramente secondarie, in particolare si pensa legate a fenomeni di resistenza al trasferimento genico o all'attacco virale.

15 Il codice genetico Ala/A GCU, GCC, GCA, GCG Leu/L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Arg/R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG Asn/N AAU, AAC Met/M AUG Asp/D GAU, GAC Phe/F UUU, UUC Cys/C UGU, UGC Pro/P CCU, CCC, CCA, CCG Gln/Q CAA, CAG Ser/S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Glu/E GAA, GAG Thr/T ACU, ACC, ACA, ACG Gly/G GGU, GGC, GGA, GGG Trp/W UGG His/H CAU, CAC Tyr/Y UAU, UAC Ile/I AUU, AUC, AUA Val/V GUU, GUC, GUA, GUG START AUG STOP UAG, UGA, UAA Codon Usage Different organisms often show particular preferences for one of the several codons that encode the same amino acid. How these preferences arise is a much debated area of molecular evolution. It is generally acknowledged that codon preferences reflect a balance between mutational biases and natural selection for translational optimization. Optimal codons in fast-growing microorganisms, like Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast), reflect the composition of their respective genomic trna pool. It is thought that optimal codons help to achieve faster translation rates and high accuracy. As a result of these factors, translational selection is expected to be stronger in highly expressed genes, as is indeed the case for the above-mentioned organisms. In other organisms that do not show high growing rates or that present small genomes, codon usage optimization is normally absent, and codon preferences are determined by the characteristic mutational biases seen in that particular genome. Examples of this are Homo sapiens (human) and Helicobacter pylori. Organisms that show an intermediate level of codon usage optimization include Drosophila melanogaster (fruit fly), Caenorhabditis eleganss (nematode worm) or Arabidopsis thaliana (wall cress).

16 Peso molecolare vs. Mr Mr e la massa molecolare relativa a 1/12 della massa dell isotopo 12C (che vale esattamente 12 u.m.a.). Mr e un rapporto, e quindi ADIMENSIONALE. 1 Da equivale alla massa di 1 g / N (6.022 x ). Spesso si usa il Da per indicare il peso molecolare, che quindi rappresenta la massa, espressa in g, di una mole di proteina. Il peso molecolare ha dimensoni di g/mole. Dal punto di vista pratico Mr e peso molecolare vengono usati indifferentemente.

17 Ka, pka e ph La costante di dissociazione acida è un valore che rappresenta, ad una data temperatura, il grado di dissociazione di un acido. Maggiore è la costante, maggiore è la tendenza dell'acido a dissociarsi, maggiore è la sua "forza". Data la reazione di dissociazione di un generico acido HA la costante di dissociazione acida corrispondente viene calcolata come in cui le parentesi quadre indicano la concentrazione molare della specie racchiusa tra esse. I valori delle costanti di dissociazione riportati in letteratura sono convenzionalmente quelli misurati a 20 C; spesso non vengono riportati i valori delle costanti, bensì i corrispondenti pk a, definiti come Per soluzioni sufficientemente diluite di acidi deboli, per i quali la concentrazione della specie indissociata [HA] può essere ragionevolmente approssimata con il valore della concentrazione nominale dell'acido, il ph è legato alla costante di dissociazione secondo l equazione di Henderson Hasselbach: ph = pka + log([a-]/[ha])

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20 Valori di pk a delle catene laterali R dissociabili degli aminoacidi Serina, Ser, S: pk ar = 13 Treonina, Thr, T: pk ar = 13 Arginina, Arg, R: pk ar = 12.5 Lisina, Lys, K: pk ar = 10.5 Tirosina, Tyr, Y: pk ar = 10.1 Cisteina, Cys, C: pk ar = 8.3 Selenocysteina, Secys, U: pk ar = 7.5 Istidina, His, H: pk ar = 6.0 Acido Aspartico, Asp, D: pk ar = 3.9 Acido Glutammico, Glu, E: pk ar = 4.1

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26 Optical activity (quantified by the rotation of the plane of polarized light as it passes through a substance) was measured long before the three dimensional structure of molecules could be determined by methods such as X-ray Crystallography (back to the very earliest work of Pasteur in the 1840s. Pasteur was studying the properties of salts of tartaric acid products of grape fermentation). The experimental assignment of optical activity was then symbolized with the letter "d" or the "+" sign (for dextrotatory, right handed or clockwise rotation of the plane of polarized light when viewed toward the light source) and "l" or "-" (for levorotatory, left hand or counterclockwise rotation). Later the "D" and "L" symbols were associated with absolute configuration based on the arbitrary, but as it turned out, correct assignment of the absolute configuration of the dextrotatory and levorotatory forms of glyceraldehyde. In this symbolism, absolute configuration is based on chemical synthesis starting with glyceraldehyde (Fischer and Rosanoff) and optical activity is specified using the "+" and "-" notation. There is no correspondence between the D,L system and the real rotation of the plane of polarized light optical activity (right + or left -) (see L-cysteine).

27 A second absolute configuration notation using the symbols R (from rectus, latin for right) and S (from sinister, latin for left) was developed by Cahn, Ingold & Prelog. In this approach, the substituents on an assymetric carbon (eg. a tetrahedral carbon with four different substituents) are prioritized by decreasing atomic number. Configuration is assigned by "looking" down the bond to the lowest priority substituent and assigning R to the configuration where the remaining subtituents are arranged clockwise in decreasing priority. S is then assigned to the molecular form where the substituents are arranged counterclockwise. Some other rules for assigning R/S configuration (double bonds account for twice the atomic number of the components): Group Priorities: SH > OH > NH 2 > COOH > CHO > CH 2 OH > C 6 H 5 > CH 3 > H Larger groups are ranked at their points of divergence, i.e. a CH 2 CH 2 SH is greater than a CH 2 CH 2 OH

28 Both threonine and isoleucine have a second assymetric carbon center at carbon position 3 along their chains. The absolute configuration of the normal protein component, L-threonine, is 2S,3R. The mirror image compound (the enantiomer) is D-threonine (2R,3S). The diastereomer with 2S, 3S configuration is called L-allo-threonine (D-allo-threonine is then 2R, 3R). For isoleucine, the configuration of normal L-isoleucine is 2S, 3S.

29 PERCHE L ISOLEUCINA E IN CONFORMAZIONE 2s,3s? COSA INDICANO I NUMERI 2 E 3? acido 2(S)-ammino-3(S)-metilpentanoico (nome IUPAC) È un acido con 5 Carboni e numerazione che parte dal C del C=O. In posizione 2 troviamo il C-alfa chirale (configurazione S) e in 3 troviamo il secondo C chirale (configurazione S)

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31 Gli aminoacidi sono le unita strutturali che costituiscono le proteine Centrale alla struttura degli aminoacidi e il carbonio α che e legato covalentemente sia al carbonio aminico che carbossilico La catena laterale (R) da ad ogni aminoacido la sua identita In soluzione neutra il gruppo carbossilico esiste come COO - e il gruppo aminico come NH 3+. E quindi uno zwitterione Gli aminoacidi sono molecole chirali

32 Stereochimica degli aminoacidi Tutti gli aminoacidi eccetto la glicina sono chirali Gli L-aminoacidi predominano in natura La nomenclatura D,L- e basata sulla D- e L- gliceraldeide Il sistema di nomenclatura R,S e migliore, dato che gli aminoacidi isoleucina e treonina (che hanno due centri chirali) possono venir classificati in maniera non ambigua

33 Aminoacidi nutrizionalmente essenziali e non Nurizionalmente essenziali Arginina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina Nurizionalmente non essenziali Alanina Asparagina Aspartato Cisteina Glutammato Glutammina Glicina Prolina Selenocisteina Serina Tirosina Non tutti gli aminoacidi possono essere sintetizzati dall uomo questi si configurano come nutrizionalmente essenziali

34 Le proteine sono polimeri non ramificati di aminoacidi la formazione del legame peptidico porta ad eliminazione di H 2 O. Lo scheletro di una proteina consiste della sequenza ripetuta -N-Cα-C-

35 Il legame peptidico e solitamente rappresentato come un legame singolo tra il carbonio carbonilico e l azoto amidico Ha parziale (40%) carattere di doppio legame L atomo di N e parzialmente positivo; l atomo di O parzialmente negativo Si trova solitamente nella conformazione trans dell O carbonilico e dell H amidico E lungo circa nm - e quindi piu corto di un tipico legame singolo (0.145 nm per un legame C-N) ma piu lungo di un doppio legame

36 Il parziale carattere di doppio legame del legame peptidico Le interazioni di risonanza fra C, O e N che partecipano al gruppo peptidico possono essere rappresentate come due estremi, ma il legame peptidico e descritto al meglio come un ibrido di risonanza tra le due forme estreme E prevista rotazione tra C-N gli atomi C e N sono ibridizzati sp2 e gli atomi C e O partecipano ad un legame p greco, lasciando all N una coppia di elettroni negli orbitali 2p Non e prevista rotazione tra C-N la coppia solitaria e sull O e C-N partecipano ad un legame p greco

37 Conseguenze della risonanza del legame peptidico La risonanza del legame peptidico ha tre conseguenze importanti: 1. Restringe le possibilita di rotazione attorno al legame peptidico sicche e possibile solo la rotazione tra Cα-CO e Cα Ν 2. I sei atomi che compongono i gruppi del legame peptidico tendono ad essere coplanari formando il piano amidico 3. Il legame peptidico e piu corto di un legame singolo e piu lungo di un legame doppio e la sua energia è di 88 kj/mol circa

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45 Idrofobici e idrofilici

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