Studio dell infertilità maschile: dall esame seminale alle microdelezioni del cromosoma Y

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Cristoforo Arturo Serra
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1 Studio dell infertilità maschile: dall esame seminale alle microdelezioni del cromosoma Y Domenico Saverio MATAROZZO Claretta MARCHI Anatomia Patologica S. Anna - Torino

2 Premessa L esame seminale è il primo passo nello studio dell infertilità di coppia, essendo quello che con meno indagini invasive ci da più informazioni sulla metà maschile della coppia. E un esame svolto per tutte le patologie a lui relative, dall infezione al varicocele, passando per tutte le nuove problematiche sessuali come deficit erettili ed astenia, fino alla pianificazione famigliare. Studio eseguito ponendo riguardo all anamnesi e sulla raccolta del materiale seminale da parte del paziente (da cui derivano principalmente i dati falsati), procedendo con una fase macroscopica per poi finire con la fase microscopica a fresco e su fissato colorato con la papanicolaou. Per indagini successive possono essere richiesti test specifici come la Capacitazione, il Test di Kremer o la ricerca di auto-anticorpi (Mar-Test). Solo dopo aver appurato l infertilità grave o la sterilità del paziente si può consigliare l esame, più specialistico e diretto a cause genetiche, delle microdelezioni del cromosoma Y su prelievo di sangue periferico.

3 STERILITA assenza del concepimento dopo 1 anno di rapporti non protetti Rinvio dei tentativi di concepimento ad età più avanzate per motivi socioculturali (economici, di carriera, etc.) Aumentata incidenza di alcune malattie sessualmente trasmesse,potenzialmente lesive della capacità riproduttiva (es. Chlamydia) Aumentati livelli di tossici ambientali in grado di interferire nei processi riproduttivi e aumentato livello di stress nella vita quotidiana

) Aumentata incidenza di alcune malattie sessualmente trasmesse,potenzialmente lesive della capacità riproduttiva

4 Raccolta del campione Esame macroscopico Esame microscopico a fresco Esame microscopico su fissato colorato Test specifici Procedure Standard

5 Raccolta campione Astinenza sessuale (2-7 giorni) Raccolta presso ambulatorio o in casi particolari a casa Conservazione a 37 c

6 Anamnesi Cognome: Nome:.. Data di nascita: Età del matrimonio:.. Rapporti non protetti:. Contraccezione:. fumo. alcool.... lavoro.. sport.. uso di farmaci. Altezza: Peso:. Altro: Erezione:

7 Anamnesi Eiaculazione: Malattie genitali: Varicocele: Dx Sx Criptorchidismo: Orchite: Dx Epidimite: Dx Dx Sx Sx bilaterale Sx operato bilaterale bilaterale bilaterale non operato operato operato operato non operato non operato non operato Prostatite Uretrite Idrocele Lesioni testicolari Eventuali esami già eseguiti:.

bilaterale non operato operato operato operato non operato non operato non

8 Esame Macroscopico Volume (V.N. compreso tra 2 ml e 6 ml) ph (V.N. compreso tra 7 e 8) Aspetto (avorio opalescente) Fluidificazione (deve essere totale dopo 1h) Viscosità (deve scendere goccia a goccia)

9 Esame Microscopico a fresco (eseguito su due preparati) Valori Normali 30 milioni/ml di spermatozoi valutati con camera di Makler dopo immobilizzazione degli spermatozoi (non richiede diluizione). Motilità normale gradi A+B 50 % valutata in almeno 5 campi. Gradi A movimento lineare veloce Gradi B movimento lineare lento Gradi C movimento in situ Gradi D immobili

Motilità normale gradi A+B 50 % valutata in almeno 5 campi.

12 Esame microscopico su fissato colorato Il vetrino strisciato viene fissato con metanolo acidificato al 5% con acido acetico e colorato con Papanicolau (oppure May-Gruwald-Giemsa o Diff Quick). Valori Normali prescrivono che siano presenti come minimo il 30% di forme Tipiche

con Papanicolau (oppure May-Gruwald-Giemsa o Diff Quick).

13 Morfologia tipica

14 Morfologie tipiche

15 Morfologie atipiche

16 Morfologie atipiche

17 Viene inoltre valutato anche altro come: Emazie Cellule epiteliali Elementi germinativi Granulociti Cristalli

18 Flogosi

19 EMOSPERMIA

20 CRISTALLI

21 Cellule

22 TEST SPECIFICI Capacitazione Kremer Mar Test

23 Capacitazione Riproduce in vitro l azione capacitante del muco vaginale. Centrifugo 1 ml di terreno (ricco in albumina umana) + 1 ml di liquido seminale Incubo 1 h a 37 c e 5% CO2 Al sedimento aggiungo 1 ml di terreno nuovo Senza risospendere Prelevo 10 microlitri dall interfase e li leggo al microscopio

24 KREMER TEST Serve a valutare la forza penetrante degli spermatozoi all interno di un capillare riempito di terreno albuminato. Capillare Chiuso ad una estremità A contatto col seminale per 1 h a 37 c Lettura al microscopio valutando 2. Penetrazione lineare 3. Densità di penetrazione 4. Motilità

MAR TEST Ricerca diretta anticorpi IgG antispermatozoi per mezzo di agglutinazione al lattice (richiede una mobilità basale A+B > 20%) 10 microlitri seminale + 10 microlitri Sperm Mar Latex Particels

25 MAR TEST Ricerca diretta anticorpi IgG antispermatozoi per mezzo di agglutinazione al lattice (richiede una mobilità basale A+B > 20%) 10 microlitri seminale + 10 microlitri Sperm Mar Latex Particels Misceliamo su un vetrino le due quantità Aggiungiamo e mischiamo 10 microlitri di Sperm Mar Antiserium Lettura della goccia così ottenuta a 40x dopo 3/10 minuti, valutando la diminuizione In % della motilità (positivo se > 40%)

27 Microdelezioni del Cromosoma Y

28 Cariotipo umano maschile: 46 XY X Y

29 Sono la seconda causa genetica di fallimento della spermatogenesi in maschi infertili dopo la Sindrome di Klinefelter : 47, XXY

30 'inversione del sesso anomalia cromosomica per la quale si hanno individui maschi XX GIF (sex-determining Gene SRY region Y ) sequenza genica specifica del maschio posizionata vicino all'estremità del braccio corto dell'y (Yp11.3) L'analisi molecolare dei cromosomi sessuali di questi soggetti ha evidenziato che nei maschi XX è presente un piccolo frammento di cromosoma del braccio corto dell'y staccatosi durante la formazione dei gameti e rimasto adeso ad uno dei cromosomi X.

31 L incidenza delle microdelezioni del Cromosoma Y (MDY) nei soggetti infertili varia dal 2 al 10 % in base ai criteri con cui vendono selezionati i pazienti. Essa è più elevata nei soggetti azospermici che negli oligospermici (Krausz et al. 1999a; Krausz et al. 1999b; Krausz et al. 2001).

32 ICSI ( Intracitoplasmatic Sperm Injection) I pazienti portatori di microdelezioni sul braccio lungo del cromosoma Y sono caratterizzati da oligospermia severa o azospermia con possibile presenza di spermatozoi all interno del testicolo recuperabili mediante TESE (Testicular Sperm Extraction)

33 L analisi delle MDY si avvale di un pannello di S.T.S. (Sequence Tag Sites) conforme alle Linee guida dell EUROPEAN ACADEMY OF ANDROLOGY e dell EMQN (European Molecular Genetics Quality Network)

34 La porzione di regione maschio-specifica (MSY) su cui mappano le delezioni è stata suddivisa in 3 regioni AZF situate sul braccio lungo del Cr. Y che contengono geni che controllano la spermatogenesi AZF a AZF b AZF c (AZF= Azospermia Factor) Le microdelezioni coinvolgono per l 80% AZFc il 9% AZFb il 6% AZFbc il 3% AZFa il 3% AZFabc (maschi XX)

35 Rappresentazione del meccanismo molecolare di insorgenza della delezione completa della regione AZFc del cromosoma Y. La ricombinazione omologa intracromosomica tra le sequenze "b2" e "b4 determina la perdita di tutta la regione interposta tra queste due sequenze.

36 Meccanismo di ricombinazione omologa intracromosomica. Due sequenze omologhe - con il 99,9% di identità - orientate nella stessa direzione si appaiano determinando la formazione di un loop; quest'ultimo è costituito dalla regione interposta tra i due ampliconi. La ricombinazione omologa degli ampliconi determina l'escissione del loop e quindi la sua rimozione dal cromosoma

37 Ricerca M.D.Y CAMPIONE ANALITICO DNA GENOMICO estratto da sangue intero

38 METODO PCR MULTIPLEX tecnica che permette l amplificazione simultanea di più loci sulla stessa regione

39 CONTROLLI CONTROLLO INTERNO Gene ZFX/ZFY CONTROLLO POSITIVO DNA di maschio fertile CONTROLLO NEGATIVO DNA di femmina

40 L analisi prevede l amplificazione di 2 marcatori (STS) per locus AZF e 2 geni di controllo STS REGIONE LOCUS (DNA Y-chromosome Segment) sy86 sy84 AZFa DYS sy127 sy134 AZFb DYS sy254 sy255 AZFc DAZ (Deleted in azoospermia) ZFX-ZFY gene di controllo presente sia nei maschi che nelle femmine

41 TECNICA DI ANALISI DNA genomico MIX A: 3 coppie di primers per STS sy 86 sy 127 sy gene ZFX/ZFY 3 MIX B: coppie di primers per STS sy 84 sy 134 sy255

42 TECNICA DI ANALISI PCR end point a ciclo unico I primers annilano alla stessa temperatura

43 TECNICA DI ANALISI RIVELAZIONE AMPLIFICATI ELETTROFORESI Gel agaroso 4% etidio bromuro

44 INTERPRETAZIONE RISULTATI Mix A Mix B 495 pb 400 pb 320 pb 326 pb 274 pb 301 pb 255 pb ZKX/ZFY sy 254 sy 255 sy 86 sy 84 sy 127 sy134

46 INTERPRETAZIONE RISULTATI Mix A Mix B 495 pb 400 pb 320 pb 326 pb 274 pb 301 pb delezione sy 254 sy 255 Regione AZFc Locus DAZ 255 pb La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla regione corrispondente

47 del 1 del M sy 254 sy 255 Regione AZFc Locus DAZ Mix A Mix B - +

48 INTERPRETAZIONE RISULTATI Mix A Mix B 495 pb 400 pb 320 pb 326 pb 274 pb 301 pb delezione sy 86 sy 84 Regione AZFa Locus DYS pb La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla regione corrispondente

49 INTERPRETAZIONE RISULTATI Mix A Mix B 495 pb 400 pb 320 pb 326 pb 274 pb 301 pb delezione sy 127 sy134 Regione AZFb Locus DYS pb La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla regione corrispondente

50 SEX REVERSAL maschio 46 XX, SRY positivo M Delez. Regioni AZFa, AZFb, AZFc Mix A Mix B SRY - +

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