I CONTROLLI DEI LABORATORI UFFICIALI: L ESPERIENZA DELL ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA

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1 IV CONVEGNO DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI SULL ALIMENTAZIONE UMANA TUTTO SULLE MICOTOSSINE I CONTROLLI DEI LABORATORI UFFICIALI: L ESPERIENZA DELL ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA dott. A. Eugenio Chiaravalle Struttura Complessa Chimica IZS-PB TORINO 11 Novembre 2011 Lingotto Fiere

2 Composto da: Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Una Sede Centrale a Foggia Sei strutture periferiche, denominate Sezioni diagnostiche provinciali : - Torre S. Susanna (BR) - Campi Salentina (LE) - Matera - Tito Scalo (PZ) - Taranto - Putignano (BA)

3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata DIREZIONE DIREZIONE DIREZIONE QUALITA - SICUREZZA -FORMAZIONE QUALITA - SICUREZZA -FORMAZIONE OSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICO OSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICO MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA VIROLOGIA VIROLOGIA TARANTO TARANTO PUTIGNANO PUTIGNANO AMMINISTRAZIONE AMMINISTRAZIONE CHIMICA CHIMICA BIOTECNOLOGIE E VACCINI BIOTECNOLOGIE E VACCINI SIEROLOGIA SIEROLOGIA LECCE LECCE BRINDISI BRINDISI POTENZA POTENZA MATERA MATERA

4 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Struttura Complessa Chimica E organizzata in sei strutture semplici: Struttura Semplice CNR Radioattività Struttura Semplice Anabolizzanti e Pesticidi Struttura Semplice Farmaci e Tossicologia Struttura Semplice Analisi bromatologiche, biotossine e farine animali Struttura Semplice Micotossine e Tecniche Immunoenzimatiche Struttura Semplice Metalli Pesanti e Mangimi

5 PRINCIPALI ATTIVITA Piano Nazionale Residui - PNR Piano Nazionale Alimentazione Animale PNAA Piano Alimenti Ricerca e controllo Biotossine Algali nei prodotti ittici Ricerca e controllo delle Micotossine Ricerca e controllo dei contaminanti negli alimenti di origine non animale (vegetali) Ricerca e controllo di additivi e conservanti negli alimenti Ricerca e controllo della radioattività negli alimenti

6 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Struttura Complessa Chimica Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario Istituito con Decreto del Ministero della Salute del 27 agosto 2004 (G.U. N 43 del 22 febbraio 2005).

7 Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario (D.M. 27 Agosto 2004) Settori di attività Controlli Radiometrici e ricerca di alimenti irradiati Progetti di ricerca e programmi di interconfronto Indagini epidemiologiche e piani di monitoraggio Attività di informazione formazione e consulenza

8 Food irradiation: metodi analitici validati IN FASE DI ACCREDITAMENTO

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11 I CONTROLLI UFFICIALI SULLE MICOTOSSINE Metodi di screening: Tecniche immunoenzimatiche Metodi di conferma: HPLC

12 CORRETTE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.)

13 CORRETTE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.) Nelle pratiche routinarie, le aliquote sono solitamente inferiori ai 100 kg. In questi casi devono essere preparati 10 campioni di cui uno destinato all analisi. Se il campione globale è di peso inferiore a 20 kg, si procede nel seguente modo: < 12 kg: nessuna suddivisione in campioni di laboratorio; 12 kg: suddivisione in due campioni di laboratorio. Per rendere omogeneo tale campione si effettua una corretta macinazione.

14 CORRETTE MODALITÀ DI MACINAZIONE

15 MACINAZIONE A SECCO

16 MACINAZIONE A SECCO

17 RISULTATI FINALI

18 MACINAZIONE A SECCO

19 MACINAZIONE A SECCO

20 MACINAZIONE IN UMIDO

21 SGUSCIATRICE

22 GRATTUGGIATRICE FRUTTA SECCA La capacità varia da kg/h a seconda del disco e del prodotto utilizzato

23 I METODI DI SCREENING ELISA Metodi interni di prova validati ed accreditati per le determinazioni di: Aflatossine B e G; Aflatossina M1; Ocratossina A; Zearalenone; Deossinivalenolo; Fumonisine B1 e B2.

24 VALIDAZIONE METODI DI SCREENING ELISA (Reg. CE n.401/2006) Metodi quantitativi di screening: Precisione Robustezza Specificità Verifica CCβ

25 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (µg/kg in matrice): CCβ: 0.5 µg/kg in matrice Recupero medio: 81.0% Precisione intermedia: CV% = 4.6%

26 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA M1 NEL LATTE Campo di misura (µg/l in matrice): CCβ: µg/l in matrice Recupero medio: 102.0% Precisione intermedia: CV% = 9.5%

27 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL OCRATOSSINA A NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (µg/kg in matrice) CCβ (µg/kg in matrice) Recupero medio 106.0% 82.0% Precisione intermedia: (CV%) 5.0% 5.5%

28 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DI ZEARALENONE NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (µg/kg in matrice) Recupero medio 96.8% 86.0% Precisione intermedia: (CV%) 13.0% 15.0%

29 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (mg/kg in matrice) Recupero medio 91.0% 89.4% Precisione intermedia: (CV%) 10.6% 7.4%

30 METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (mg/kg in matrice) Recupero medio 117.0% 104.0% Precisione intermedia: (CV%) 4.0% 4.0%

31 I METODI DI CONFERMA HPLC/FLD Metodi interni di prova validati per la determinazione di: Aflatossine B e G (acceditato); Aflatossina M1 (accreditato); Fumonisine B1 e B2 (in corso di accreditamento); Deossinivalenolo e Nivalenolo (in corso di accreditamento).

32 VALIDAZIONE METODI DI CONFERMA HPLC/FLD (Dec. 657/2002/CE) Parametri di validazione: Linearità strumentale; Specificità; LOD e LOQ; Precisione (CV%); Recupero %; Robustezza; Incertezza di misura.

33 METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI (B1, B2, G1, G2) NEI CEREALI E NELLA FRUTTA A GUSCIO MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi. AFLATOSSINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) Incertezza di misura: 13.1% RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (CV%) B % 4.9% B % 9.1% G % 7.7% G % 8.8%

34 METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA B1 NELLE MATERIE PRIME PER MANGIMI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Avena, Mais. AFLATOSSINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (CV%) B % 7.0% Incertezza di misura: 8.8%

35 LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA Le procedure di conferma sfruttano la rivelazione fluorimetrica accoppiata ad opportune reazioni di derivatizzazione post-colonna. Nel caso delle Aflatossine viene impiegata la derivatizzazione fotochimica. Le Aflatossine B1 e G1 non sono naturalmente fluorescenti, grazie a questa reazione possono emettere in fluorescenza.

36 LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA

37 LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA B2 Senza G2 derivatizzazione G1 B1 B1 G1 B2 Con derivatizzazione G2

38 ANALISI DELLE AFLATOSSINE CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA

39 I VANTAGGI DELLA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA ON-LINE POST-COLONNA La possibilità di lavorare in modo automatizzato, grazie al derivatizzatore fotochimico on-line, permette di aumentare notevolmente la riproducibilità dell analisi, semplificando inoltre la fase di pre-trattamento del campione; La derivatizzazione effettuata post-colonna rende notevolmente più ripetibili i t.r. degli analiti rispetto a quando viene effettuata pre-colonna. Muscarella, M; Iammarino, M; Nardiello, D; Lo Magro, S; Palermo, C; Centonze, D; Palermo, D. (2009).Validation of a confirmatory analytical method for the determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in foods and feed materials by HPLC with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection. Food Addit. Contam. 26:

40 METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA M1 NEL LATTE MEDIANTE HPLC Campo d applicazione: Latte Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo di misura: µg/kg in matrice Limite di rivelabilità: µg/kg in matrice Recupero medio: 91.3% Precisione intermedia: CV% = 10.0% Incertezza di misura: 7% Muscarella, M; Lo Magro S.; Palermo, C.; Centonze, D. (2007). Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk based on immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal. Chim. Acta 594:

41 ANALISI DI CONFERMA PER AFLATOSSINA M1 CAMPIONE DI LATTE CONTAMINATO (AFLATOSSINA M1 =0.158 µg/l)

42 METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE B1 E B2 NEI PRODOTTI ALIMENTARI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Avena, Mais. FUMONISINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO PRECISIONE MEDIO INTERMEDIA (CV%) B % 4.1% B % 4.7%

43 LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Per le fumonisine è stata sfruttata la possibilità di derivatizzare chimicamente la funzione amminica primaria presente in questi composti mediante reazione con una miscela di agenti derivatizzanti composta da o-ftalaldeiede (OPA) e N,N-dimetil-2-mercaptoetilammina (Thiofuor ). HOOC COOH OPA CHO O O O O R OH OH NH 2 N CHO SH N N S OH FB HOOC COOH Thiofluor TM FB

44 ANALISI DELLE FUMONISINE CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA

45 ANALISI DI CONFERMA PER FUMONISINE Campione di farina di mais contaminato (FB1+FB2 = 169 µg/kg)

46 METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL MAIS MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Mais. MICOTOSSINA CAMPO DI MISURA LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (µg/kg in matrice) (CV%) DON % 6.9% NIV % 7.9% Muscarella, M.; Lo Magro, S.; Nardiello, D.; Palermo, C.; Centonze. D. (2008) Development of a new analytical method for the determination of fumonisins B1 and B2 in food products based on high performance liquid chromatography and fluorimetric detection with post-column derivatization. J. Chromatogr. A 1203:88-93.

47 LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Per deossinivalenolo e Nivalenolo è stata impiegata una derivatizzazione chimica post-colonna a 2 step. Nella prima fase, il DON e NIV, a caldo ed in soluzione alcalina, si frammentano formando vari sottoprodotti, con rilascio di formaldeide. H 3 C O OH 115 C H 3 C O OH 115 C O CH 3 CH 2 OH OH O R OH - HO CH 3 CH 2 OH OH O R OH - O + P.D. DON (R = H) NIV (R = OH)

48 LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Nella seconda camera di reazione, la formaldeide generata reagisce con metilacetoacetato ed ammonioacetato, producendo un derivato diipropiridinico fluorescente, secondo la reazione di Hantzsch. O O O O O O O O O O O O NH 3 O NH 2 N

49 ANALISI DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL MAIS CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA

50 ANALISI DI CONFERMA PER DEOSSISINIVALENOLO E NIVALENOLO Segnale / L.U (b) (a) N IV D O N T em po / m in Campione di grano fortificato con 1.75 mg/kg di DON e NIV

51 RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI I metodi di conferma HPLC per la determinazione di micotossine nei prodotti per alimentazione umana ed animale sono stati inseriti nel volume: MICROBIAL TOXINS A cura di: Otto Holst Editore: Humana Press Inc. Collana: Methods in Molecular Biology Inoltre sono disponibili, in lingua italiana, sul numero di Febbraio 2011 della rivista Laboratorio2000.

52 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE ANNO 2009 (n. 1004) Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Ocratossina A 23 Fumonisine T2 Vomitossina Aflatossina M1 73 Assente Presente ma conforme

53 N. Campioni ATTIVITÀ ANNO 2009 MANGIMI (n.938) Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A T2 Vomitossina Zearalenone

54 ATTIVITÁ ANNO 2009 (n.10) Presente ma conforme Assente - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Ocratossina A CEREALI AD USO UMANO (n.6) ALTRO LATTE E DERIVATI (n.221) Aflatossina M1 Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine

55 N. Campioni ATTIVITÀ ANNO 2009 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA 5 MANGIMI (n.11) LATTE E DERIVATI (n.4) CEREALI AD USO UMANO (n.1) ALTRO (n.2) 2 Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Fumonisine Ocratossina A Vomitossina Zearalenone - - Aflatossina B1 - - Aflatossina M1 - - Ocratossina A

56 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE ANNO 2010 (n. 1172) Aflatossina B1 1 Aflatossine totali Deossinivalenolo 44 Ocratossina A Fumonisine T2 Aflatossina M Assente Presente ma conforme Non conforme

57 ANNO 2010 MANGIMI (n.945) N. Campioni Aflatossina B Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A T2 Zearalenone Non conforme (1) Presente ma conforme Assente

58 N. Campioni ATTIVITÁ ANNO 2010 CEREALI AD USO UMANO (n.271) Non conforme Presente ma conforme Assente ALTRO 3 1 (n.7) LATTE E DERIVATI (n.187) Aflatossina M Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Ocratossina A Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo

59 N. Campioni ATTIVITÀ ANNO 2010 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA CEREALI AD USO UMANO (n.256) Presente ma conforme Assente MANGIMI 1 4 (n.13) LATTE E DERIVATI (n.4) 1 3 ALTRO 2 (n.2) Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina - B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone Aflatossina M1 - - Ocratossina - A

60 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE Aflatossina B Aflatossine totali Deossinivalenolo Ocratossina A ANNO 2011 (n. 978) Fumonisine T2 Aflatossina M Assente Presente ma conforme Non conforme

61 ANNO 2011 MANGIMI (n.809) N. Campioni Aflatossina B Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A T2 Zearalenone Non conforme (2) Presente ma conforme Assente

62 N. Campioni ANNO Zearalenone CEREALI AD USO UMANO Non conforme (3) Presente ma conforme Assente LATTE E DERIVATI Aflatossina M1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Aflatossina B1

63 N. Campioni RISULTATI 2011 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA CEREALI AD USO UMANO MANGIMI 27 LATTE E DERIVATI Non conforme (1) Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Deossinivalenolo Ocratossina A - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina M1 - -

64 Grazie per l attenzione