COME VIENE METABOLIZZATA QUESTA MASSICCIA QUANTITA DI ENERGIA? Trasformazione di energia potenziale di riduzione. energia libera di fosforilazione

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1 Trasformazione di energia potenziale di riduzione in energia libera di fosforilazione Un uomo adulto produce in media abbastanza energia da sintetizzare ogni giorno una quantità di ATP pari al suo peso corporeo. COME VIENE METABOLIZZATA QUESTA MASSICCIA QUANTITA DI ENERGIA? 1

2 L a m a g g i o r p a r t e dell energia liberata durante l ossidazione dei carboidrati, dei grassi e aminoacidi nelle cellule aerobiche e resa disponibile all interno del mitocondrio come equivalenti riducenti ( H o elettroni), è raccolta nella C a t e n a respiratoria che la dirige verso l ossigeno che sarà ridotto ad H 2 O. L energia liberata da questo processo sarà poi intrappolata nella formazione di ATP da ADP e P i. 2

3 Permeabile a molte molecole Impermeabile a molte molecole e ioni incluso l H +. Contiene q I complessi della catena respiratoria q I trasportatori di ADP e ATP q L ATP sintasi q Altri trasportatori di membrana La densità delle creste è determinata dall attività respiratoria della cellula N versante matrice P versante citosolico Nei procarioti la fosforilazione ossidativa avviene sulla membrana interna cellulare Membrana interna 70% di proteine 30% lipidi 3

4 Il flusso degli e - nelle reazioni di ossido-riduzione è responsabile, direttamente o indirettamente, di tutto il lavoro prodotto dagli organismi viventi. Le cellule contengono una grande varietà di molecole che si comportano da TRASDUTTORI ENERGETICI Sostanza meno affine e - Forza elettromotrice fem Sostanza più affine Il trasporto biologico di elettroni consiste in una serie di ossidazioni e riduzioni accoppiate: REAZIONI REDOX Per capire la logica di questo meccanismo occorre capire come si calcola L ENERGIA LIBERA ottenibile da una REAZIONE REDOX 4

5 OSSIDAZIONI BIOLOGICHE POTENZIALE REDOX PRODUZIONE DI ENERGIA VARIAZIONE DI ENERGIA LIBERA Come si calcola il ΔG ottenibile da una reazione REDOX? La misura della tendenza di un riducente a perdere elettroni è determinata dal suo potenziale di ossidazione E ( capacità di cedere elettroni) ma anche dal potenziale di ossidazione della molecola ossidante (capacità di ricevere elettroni). Facilità a cedere elettroni In condizioni standard ( 25 C, 1M ) E 0 dell elettrodo ad idrogeno è = 0 Facilità ad acquistare elettroni In condizioni standard (25 C, conc. 1M) il potenziale di ossido riduzione (o potenziale di ossidazione) diventa: POTENZIALE STANDARD DI OSSIDAZIONE E. 5

6 * Questo valore è specifico della riboflavina che lega la succinato deidrogenasi In una reazione spontanea gli elettroni scorrono dalla semicella a più basso potenziale a quella a più alto potenziale ΔE rappresenta la tendenza di un composto riducente a perdere elettroni, nello stesso senso in cui il pk a rappresenta la tendenza di un acido a perdere protoni In BIOCHIMICA le condizioni standard comprendono anche un valore di ph pari a 7 e il Potenziale standard di ossido-riduzione diventa E 0 a ph 7 la coppia 2H + /H 2 E 0 = - 0,42 Volt e il NADH + H + / NAD + E 0 = - 0,32 Volt Ne deriva che il NADH cederà elettroni all idrogeno a ph = 0 ma accetterà elettroni dall idrogeno a ph 7 La coppia O 2 /H 2 O E 0 = +0,82 Volt presenta una forte tendenza ad ossidare le altre sostanze La fotosintesi, che ossida l H 2 O ad O 2, richiede per realizzare questo compito un considerevole apporto di energia sottoforma di luce 6

7 Tanto più è elevato in una coppia redox il valore di E tanto maggiore è la tendenza di questa coppia ad ossidare un altro substrato. Questa tendenza determinata dal ΔE 0 (differenza di potenziale tra l accettore e il donatore di elettroni) scriviamola ora in termini quantitativi di Energia Libera (ΔG 0 ) ΔG 0 = -n F ΔE 0 = -n F [E 0 (accettore) E 0 (donatore)] n = numero di elettroni trasferiti F = costante di Faraday ( 96,5 KJ / mole Volt) ΔE 0 = differenza di potenziale standard di ossido/riduzione della coppia redox quando ΔE 0 negativo ΔG 0 positivo reazione non favorita NADH + H + + ½ O 2 NAD + +H 2 O Reazione altamente ESOERGONICA ΔG 0 = -n F ΔE 0 = - 2 (96,5) [ 0,82- ( - 0,32) ] = kj/ mole Gli elettroni dal NADH vengono trasferiti all ossigeno attraverso una catena composta di tre complessi proteici Il flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria causa la fuoriuscita di protoni dalla matrice mitocondriale. 7

8 Gli elettroni dal NADH vengono trasferiti all ossigeno attraverso una catena composta di tre complessi proteici Il flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria causa la fuoriuscita di protoni dalla matrice mitocondriale. Poiché la membrana mitocondriale interna è impermeabile agli ioni e soprattutto ai protoni, si crea una forza motrice generata dai protoni che determinano un gradiente di ph e da un potenziale elettrico transmembrana. L ATP viene sintetizzato quando i protoni rientrano nella matrice mitocondriale attraverso un complesso enzimatico. Gli elettroni arrivano alla catena respiratoria con la molecola riducente di NADH prodotto dalle diverse deidrogenasi nel catabolismo dei grassi, zuccheri e aminoacidi. Gli e- vengono trasferiti all O 2 attraverso una catena composta di tre complessi proteici che sono anche pompe protoniche chiamati: NADH-Q reduttasi ( complesso mitocondriale I ) Citocromo reduttasi (complesso mitocondriale III ) Citocromo ossidasi (complesso mitocondriale III ) (complesso mitocondriale II) Succinato Q reduttasi (succinato deidrogenasi) trasporta elettroni all ossigeno ma non è una pompa protonica 8

9 In una reazione spontanea gli elettroni scorrono dalla semicella a più basso potenziale a quella a più alto potenziale Gli elettroni fluiscono lungo la catena respiratoria attraversando una differenza di potenziale di 1,1 Volt dalla coppia redox NADH/NAD + al la coppia O 2 /H 2 O In una reazione spontanea gli elettroni scorrono dalla semicella a più basso potenziale di ossidazione a quella a più alto potenziale di ossidazione Flavoproteine e proteine ferro-zolfo sono cofattori dei complessi della catena respiratoria 9

10 Le flavo proteine sono componenti dei complessi I e II Le proteine ferro-zolfo sono componenti dei complessi I, II e III e possono contenere 1, 2 o 4 atomi di ferro legati alle cisteine Il NADH proveniente dalle diverse deidrogenasi del catabolismo si lega all enzima trasferendo i suoi elettroni al gruppo prostetico FMN della NADH-Q reduttasi o NADH deidrogenasi Inizio NADH + H + + FMN D FMNH 2 + NAD + NADH-Q reduttasi Complesso multimerico composto da 25 singole cat. polipeptidiche e da vari centri ferro zolfo 10

11 NADH + H + FMN Fe 2+ S CoQ NAD + FMNH 2 Fe 3+ S CoQH 2 Gli elettroni sono poi trasferiti al coenzima Q UBICHINONE (prodotto della reazione ) Derivato chinonico con una lunga coda isoprenoide Il flusso di elettroni dal NADH all ubichinone attraverso la NADH-Q reduttasi, che è una pompa protonica, causa il TRASPORTO di 4H + dalla MATRICE al versante CITOSOLICO della MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA NADH + H + FMN Fe 2+ S CoQ NAD + FMNH 2 Fe 3+ S CoQH 2 L energia di ossidazione che si sviluppa nella reazione viene spesa per pompare protoni contro il gradiente elettrochimico transmembrana 11

12 L UBICHINOLO diffonde all INTERNO della membrana mitocondriale interna dal complesso I al complesso III, dove viene ossidato (perde gli elettroni) in un processo che comporta ancora lo spostamento di protoni attraverso la membrana L UBICHINONE è anche il punto di ingresso degli elettroni trasportati dal FADH 2 Complesso II Succinato deidrogenasi Succinato CoQ reduttasi Il FADH 2 ( gruppo prostetico) NON SI DISSOCIA dall enzima ma passa prima i suoi elettroni ad un centro Fe-S e quindi al CoQ 12

13 Al coenzima Q arrivano anche gli elettroni da altri enzimi flavinici : dalla glicerolo-3-fosfato deidrogenasi e dall acil-coa deidrogenasi SECONDA POMPA PROTONICA Proteina di colore rosso contenente u gruppi eme Tre classi distinguibili in base agli spettri di assorbimento alla luce I gruppi eme presenti nei citocromi 13

14 CICLO DELL UBICHINONE Sulla struttura del complesso III e sugli studi biochimici delle reazioni redox è stato proposto un ragionevole modello: Forma semichinonica radicale libero 14

15 Equazione netta QH 2 + 2Cit C (oss) + 2H + N Q + 2 Cit C (rid) + 4H + P L ubichinone trasporta 2 e- a trasportatori di 1 solo e- CITOCROMO C piccola proteina solubile nello spazio intermebrana che può legarsi mediante interazioni elettrostatiche alla superficie esterna della membrana interna trasporta 1 elettrone al quarto complesso multienzimatico la QUARTA POMPA PROTONICA Trasporta gli elettroni dal citocromo C all O 2 molecolare riducendolo ad H 2 O. Costituita da 13 subunità, pm = 204 KD Ogni qual volta 4 e- passano dal citocromo attraverso i centri eme a e a 3 e il centro rame Cu B all ossigeno 4H+ della matrice vengono adoperati per formare H 2 O ed 4H + sono pompati nello spazio intermembrana sfruttando l energia della reazione redox 4 Cit C (rid) + 8H + N + O 2 4Cit C (oss) + 4H+ P + 2H 2 O 15

16 L energia rilasciata durante il trasferimento di elettroni viene efficientemente conservata in un GRADIENTE PROTONICO NADH + H + + ½ O 2 NAD + + H 2 O ΔG 0 = KJ/mol FADH 2 + H + + ½ O 2 FAD + H 2 O ΔG 0 = KJ/mol NADH + 11 H + N + ½ O 2 E-FADH H + N + ½ O 2 NAD H + P + H 2 O E-FAD + 6H+ P + H 2 O 16

17 Gran parte di questa energia viene usata per pompare protoni attraverso la membrana interna mitocondriale Il trasporto respiratorio degli elettroni può essere considerata come una serie di reazioni ESOERGONICHE accoppiate in cui l energia libera totale resa disponibile dall ossidazione del NADH da parte dell O 2, è rilasciata in una serie di piccoli passi, alcuni dei quali sono sufficientemente esoergonici da produrre 31 KJ/mole necessari per promuovere la sintesi di ATP 4H + 4H + 2H + 17

18 La teoria chemiosmotica proposta da Peter Mitchell nel 1961, postula che il processo di ossidazione e quello di fosforilazione sono associati da un gradiente di protoni attraverso la membrana mitocondriale in modo che la forza motrice protonica data dalla differenza di potenziale elettrochimico azioni il meccanismo di sintesi dell ATP. ADP + Pi + nh + P ATP +H 2 O + nh+ N Energia di trasporto di elettroni Trasporto attivo di protoni sintesi di ATP porzione di membrana mitocondriale interna ottenuta da cuore di bovino: mostra particelle a forma di bottone Preparazione purificata delle particelle a forma di bottone ottenute da mitocondri di fegato di ratto. 18

19 ADP + Pi ATP + H 2 O Questo grande complesso enzimatico catalizza la formazione di ATP a partire da ADP e Pi accompagnato dal flusso di protoni dal lato P al lato N della membrana mitocondriale interna L ATPsintasi o COMPLESSO V è formato da due DOMINI FUNZIONALI F O Sensibilità all oligomicina F 1 (il bottone) F 1 proteina periferica catalizza la sintesi di ATP (F 1 ATPasi) F O proteina integrale di membrana ha un canale per i protoni ADP + Pi ATP +H 2 O ΔG 0 = 0 Quando l ATP è sulla superficie di F 1 è stabile quanto l ADP L ATPsintasi rende l ATP stabile quanto i suoi prodotti di idrolisi tenendolo saldamente legato e fornendo in questo modo l energia necessaria per controbilanciare quella richiesta dalla sintesi. L enzima lega l ATP con affinità maggiore che per l ADP 19

20 La maggior barriera energetica è determinata dal rilascio di ATP e non dalla sua formazione L energia richiesta per il rilascio dell ATP è fornita dalla forza motrice protonica Struttura del complesso F 1 9 subunità: α 3 β 3 γ δ ε Un dominio è in contatto con una sub. βvuota 20

21 Le sequenze aa delle sub. β sono uguali ma le conformazioni differiscono a causa dell associazione con sub. γ. Le differenze si estendono ai loro siti di legame per l ATP e ADP β-atp β-adp β-vuota Questa differenza è di cruciale importanza per il meccanismo d azione dell intero complesso 21

22 Il complesso Fo costituisce il CANALE PROTONICO ed è composto da tre subunità a Eliche trans-membrana perpendicolari al piano della membrana disposte in cerchi concentrici b 2 c La catalisi rotazionale sta alla base del meccanismo di variazione di legame per la sintesi di ATP I 3 siti attivi di F 1 catalizzano a turno la sintesi di ATP 3) Forma β--vuota ATP sintetizzato Lascia la superfice 2) Forma β--atp Stato di equilibrio Cambiamento conformazionale 1) ADP e Pi si legano al sito β-adp 22

23 Modificazioni conformazionali Dovute al passaggio di protoni attraverso la porzone Fo dell ATPsintasi Il passaggio di protoni provoca la rotazione del cilindro delle sub. c e della γ ad esso attaccata. Ogni rotazione di 120 pone a contatto la sub. γ con una nuova sub. β costringendola ad a s s u m e r e l a conformazione β-vuota 23

24 xadp +xp i + ½ O 2 + H + + NADH + xatp + H 2 O + NAD + X = rapporto P/O si supponeva n intero Rapporto maggiore di 1 quando viene ossidato il NADH rispetto al succinato Substrato N protoni N e- / ATP Rapporto P/ O NADH ,5 Succinato 6 4 1,5 I disaccoppianti dissociano il flusso di elettroni della catena respiratoria dalla fosforilazione 24

25 Agiscono dissipando il gradiente di protoni Valinomicina : IONOFORO Nigericina: antiporto K + /H + PROTEINA CANALE PER GLI IONI H + Piante calde che emanano cattivo odore Processo respiratorio alternativo L energia che potrebbe essere conservata come ATP viene rilasciata sottoforma di calore ARACEE Filodendri Gigli bianchi cavoli Producono calore prima dell impollinazione determinando l evaporazione di molecole maleodoranti 25

26 MITOCONDRI DISACCOPPIANTI TESSUTO BRUNO ADIPOSO 26