BLAST. W = word size T = threshold X = elongation S = HSP threshold

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1 BLAST Blast (Basic Local Aligment Search Tool) è un programma che cerca similarità locali utilizzando l algoritmo di Altschul et al. Anche Blast, come FASTA, funziona: 1. scomponendo la sequenza query in parole di pochi amminoacidi, di solito 2 o 3 (parametro W) e generando una lista di parole affini (diverso da FASTA) con la matrice di sostituzione (BLOSUM). Le parole affini conservate dovranno avere uno score superiore ad una soglia fissata T 2. Le parole affini sono ricercate nella banca dati per match esatti ed una volta trovate le sequenze che li contengono questi vengono estesi a dx e sx dell allineamento per una certa profondità stabilita dal parametro X e le coppie di segmenti, presenti nella stessa coppia di sequenze, che totalizzano un punteggio di similarità statisticamente significativo, superiore ad una soglia S, vengono definiti HSP (High scoring Segment Pairs). 3. Nella stessa coppia possono esserci più HSP di cui é anche possibile calcolare la probabilità di occorrenza (Karlin & Altschul, 1993). W = word size T = threshold X = elongation S = HSP threshold

2 Si definisce MSP (Maximal scoring Segment Pair) la coppia di segmenti, di eguale lunghezza, che realizza il massimo punteggio di similarità nel confronto di due sequenze; l algorimo ne valuta in modo rigoroso la significatività statistica (Karlin & Altschul, 1990, 1993).

3 BLAST two hit method le versioni attuali di Blast adottano il Two hit method che deriva dall'osservazione che il tempo di esecuzione dell'algoritmo e' principalmente impiegato nell'allungamento degli Hits per ottenere gli HSPs. L'algoritmo allora considera solo i casi in cui esistono due hit sulla stessa diagonale ad una distanza inferiore ad un parametro A prima di cercare gli HSPs. Per non perdere in sensibilità e' stata abbassata la soglia di T. L'algoritmo è più veloce e non ha perso in precisione Nella sua attuale implementazione, inoltre, BLAST considera anche i gap nel tentativo di unire, quindi, degli HSP "ungapped" che sono spazialmente vicini nella matrice di allineamento e la cui unione in un unico frammento (contenente gap ed inserzioni) non comporta un peggioramento dello score finale ma un miglioramento complessivo. Il tutto secondo dei nuovi parametri che regolano i costi e le penalità della presenza di gap nell'allineamento. Il parametro A

4 BLAST I vari algoritmi differiscono molto per il metodo con cui definiscono una sequenza casuale. BLAST calcola a priori la probabilità che un certo punteggio sia significativo sulla base della dimensione e composizione della banca dati applicando: λs E( S) = kmne m è la lunghezza della sequenza query e n è la lunghezza in residui della banca dati λ e K sono precalcolati secondo una distribuzione standard interna al contrario di FASTA. Il punteggio è simile a quello di FASTA La significatività di un risultato è espressa come valore E(S) (Expectation). Più basso il valore di E più significativo è l allineamento. Un valore di 1.0e-5 per esempio vuol dire che la probabilità di avere per caso una sequenza con lo stesso score della mia query è uguale a 1.0e-5; ovvero l attesa è che ogni sequenze se ne possa, in media, trovare una (1/100000) che totalizzi un punteggio uguale o migliore di 1.0e-5.

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7 CONFRONTO BLAST E FASTA fasta3 proteina o DNA contro banca dati o proteici o DNA rispettivamente fastx/y3 DNA contro banca dati proteico, traduzione nei 6 frame tfastx/y3 proteina contro banca dtai di DNA tradotto blastn query DNA banca dati DNA blastp query proteina banca dati proteine blastx query DNA (tradotta nei sei frame di lettura) banca dati proteine tblastn query proteina banca dati DNA (sequenze tutte tradotte nelle sei fasi di lettura) tblastx query DNA (tradotta nei sei frame di lettura) banca dati DNA (tradotta nei sei frame di lettura) SIMILARITA USO DELLA SCORING MATRIX K-TUPLE FASTA Locale (e' in genere riportato solo il miglior allineamento locale) Durante la estensione nella fase B. In questo caso il calcolo si effettua nella prima fase solo per identità 1-2 aa / 4-6 nt BLAST Locale (e' riportata la serie di allineamenti locali sopra il valore soglia tra query e subject: al contrario di FASTA si riescono ad individuare repeat e zone eventuali di overlap tra gli allineamenti locali che sono eliminate da FASTA nella fase C) Fase di scansione per W e fase di estensione per gli HSP l'algoritmo e' ottimizzato per ricercare parole W "simili" e non esatte. Si traduce il tutto in una maggiore sensibilità di ricerca rispetto a FASTA per le proteine. 3 aa / 11-12nt. A livello nucleotidico, non essendo applicate matrici di similarità che perdono di significato avendo solo 4 simboli (A,C,G,T), BLAST perde in sensibilità avendo W=11 GAP Consentiti nella fase C Consentiti nella versione attuale VELOCITA' Da 1/2 ad 1/5 di BLAST Da 2 a 5 volte maggiore di FASTA SPECIFICITA' Migliore per il confronto di sequenze nucleotidiche Migliore per il confronto di sequenze proteiche

8 CONFRONTO BLAST E FASTA Calcolo statistico K e λ E-value E( S) = kmne λs FASTA Calcolati dinamicamente m -> lunghezza sequenza query n -> numero sequenze della banca dati BLAST Precalcolati per quella determinata matrice di sostituzione e valore di gap penalties m -> lunghezza sequenza query n -> numero residui o nucleotidi totali della banca dati E( x S) E( S) = kmne λs S ln K S' = λ ln 2 E = mn2 S '

9 Alcuni esempi di interfacce web FASTA ( BLAST (