JM. SABLAYROLLES UMR Sciences pour l oenologie. INRA, 2, place Viala Montpellier cedex 1. France

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1 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 1 COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE? JM. SABLAYROLLES UMR Sciences pour l oenologie. INRA, 2, place Viala 347. Montpellier cedex 1. France Sono molti i meccanismi che possono dare problemi di fermentazione in condizioni enologiche. Molti sono stati chiariti [1, 2] ma la questione essenziale per gli enologi è la frequenza con cui si verificano nella pratica e conseguentemente essere a conoscenza del modo migliore per prevenire eventuali problemi durante la vinificazione. CHE COSA SONO I MOSTI POCO FERMENTESCIBILI? Quando si misurano precisamente le cinetiche di fermentazione (monitorando la produzione di CO 2, per esempio) si possono distinguere due tipi di curve (figura 1): (i) le fermentazioni con un basso tasso di produzione di CO 2 vengono chiamate lente e sono caratterizzate dal basso valore della produzione massima di CO ((dco 2 2/dt) max). (ii) le fermentazioni con una netta diminuzione della velocità alla fine vengono chiamate fermentazioni stentate (o interrotte, quando lo zucchero residuo è superiore a 2g/l). Le fermentazioni stentate possono essere individuate dal basso valore della pendenza della curva della (dco 2 /dt) max alla fine della fermentazione. dco2/dt (g.l -1.h-1) 1,5 1,25 1,,75,5,25 (2) (1), T (h) (dco2/dt)max (g/l.h) Assimilable nitrogen (mg/l) Figura 1. Variazioni nella produzione della CO2 durante la fermentazione. Tipo 1: fermentazione lenta Tipo 2: fermentazione stentata [3] Figura 2: Relazione tra la produzione massima di CO2 e la concentrazione di azoto assimilabile [4] Questa distinzione è fatta raramente nella pratica e i due tipi di fermentazione possono avere la stessa durata di fermentazione. Ciò nonostante, la differenza è fondamentale, sia perché (a) corrispondono a diversi meccanismi microbiologici e (b) perché le fermentazioni stentate sono molto più problematiche, dal momento che possono comportare arresti di fermentazione. E POSSIBILE INDIVIDUARE I MOSTI POCO FERMENTESCIBILI? Le fermentazioni lente sono causate da carenze di azoto, che limitano la produzione di CO2 (figura 2). Possono essere previste stimando la concentrazione di azoto assimilabile nel mosto. Uno studio statistico condotto con 178 campioni di mosto [3] indica che l anno e la regione di origine influenzano in modo significativo il rischio di fermentazioni lente. Al contrario, non è stato

2 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 2 trovata nessuna influenza significativa della varietà, che dimostra l eterogeneità del contenuto di azoto nell ambito della stessa varietà, in quanto dipendente dalla regione, anno, ecc. Le fermentazioni stentate sono caratterizzate da una scarsa vitalità finale dei lieviti, dovuta principalmente alle alte concentrazioni di etanolo e a carenze di ossigeno. Contrariamente alle fermentazioni lente, gli studi statistici indicano che, per quanto riguarda le fermentazioni stentate, non c è una correlazione significativa con la concentrazione di azoto del mosto. Più in generale, e con l eccezione della concentrazione iniziale di zuccheri, il rischio di fermentazioni stentate sembra non essere correlato con i valori del mosto o del mosto-vino nella prima metà della fermentazione, inclusa la vitalità a metà fermentazione. PERCHÉ SI AGGIUNGONO OSSIGENO O AZOTO? Le carenze di ossigeno e di azoto sono le più rilevanti. L ossigeno è richiesto dai lieviti per la sintesi dei composti cellulari, soprattutto degli steroli e degli acidi grassi insaturi, necessari per mantenere l integrità della membrana citoplasmatica (specialmente a concentrazioni elevate di etanolo). La sua aggiunta determina una diminuzione della sintesi di acidi grassi a catena media (coinvolti nel metabolismo dei lipidi) che sono conosciuti come inibitori dei lieviti [5]. Il fabbisogno di ossigeno è differente a seconda della composizione del mosto, specialmente della torbidità. L azoto assimilabile, che solitamente include l azoto ammoniacale e gli α-amminoacidi, è necessario per la sintesi delle proteine e per la crescita dei lieviti. La quantità media di ossigeno richiesta è compresa tra 5 e 1 mg/l [6], mentre secondo le norme Europee la quantità massima di azoto che si può aggiungere è di 3 mg/l di fosfato o solfato di ammonio. E IMPORTANTE IL MOMENTO IN CUI SI AGGIUNGONO L OSSIGENO E L AZOTO AMMONIACALE? L aggiunta combinata di ossigeno e di azoto ammoniacale può essere efficace, ma solo quando viene effettuata nel momento giusto per esempio a metà fermentazione (figura 3). Infatti, quando l azoto viene aggiunto all inizio della fermentazione, ha un forte impatto sulla popolazione dei lieviti e quindi sulla produzione massima di CO 2 ma lo stesso tasso di produzione di CO 2 diminuisce bruscamente e la fermentazione non risulta più corta ; l aggiunta a metà fermentazione, invece, porta a una fermentazione più efficiente anche alla fine. Allo stesso modo, l aggiunta di ossigeno risulta avere un impatto maggiore sulla cinetica di fine fermentazione, quando viene effettuata a metà fermentazione (aumentando la vitalità finale dei lieviti) O1 O2 O3 N1 N3 N O1 O2 O3 N1 N3 N2 Figure 3a Figure 3b

3 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG dco2/dt (g/l.h) 1..5 O3N1 dco2/dt (g/l.h) 1..5 O3N t (h) t (h) Figure 3c Figure 3b Figura 3: Effetto del momento dell aggiunta di 3mg/l di (NH4) 2 HPO 4 e di 5mg/l di ossigeno sulla concentrazione di zuccheri residui (figura 3a), sulla durata di fermentazione (figura 3b) e sulla cinetica di fermentazione (figure 3c e 3d). 1: inizio di fermentazione, 2: fine della fase di crescita, 3: metà fermentazione [7]. L AGGIUNTA DI OSSIGENO E DI AZOTO AMMONIACALE RISULTA ESSERE SEMPRE EFFICACE? 72 mosti che portavano a fermentazioni stentate o interrotte, vennero fermentati con l aggiunta combinata di ossigeno e di fosfato diammonico a metà fermentazione. In tutti i casi, l aggiunta combinata portò a (i) una netta diminuzione della durata della fermentazione (nel caso delle fermentazioni stentate): la durata della fermentazione diminuì in media di circa il 44% (figura 4), o (ii) a all esaurimento degli zuccheri (nel caso delle fermentazioni interrotte): 13 fermentazioni con una concentrazione di zuccheri residui compresa tra 6g/l a 38g/l. L effetto non dipendeva dalla varietà,dall origine del mosto e dal ceppo di lievito. Queste aggiunte vennero fatte anche in 9 mosti senza rischi e la durata diminuì di circa il 35% in media, dimostrando che l aggiunta di ossigeno e di azoto ammoniacale era comunque efficace anche quando non è indispensabile. 25 Duration (combined addition) (h) Duration (control) (h) Figura 4a Figura 4b

4 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 4 Figura 4: Effetto dell aggiunta di 3mg/l di (NH4) 2 HPO 4 e di 5mg/l di ossigeno sulla durata della fermentazione (fermentazioni stentate: figura 4a) e sulla concentrazione di zuccheri residui (fermentazioni interrotte: figura 4b) [3] Anche se riguardano solo le fermentazioni di vini bianchi e rosati, questi risultati indicano che l aggiunta di ossigeno e di azoto ammoniacale è il trattamento più efficace nel prevenire le fermentazioni stentate o interrotte. Benché l impatto potenziale di questi due nutrienti sulla fermentazione sia sempre stato conosciuto, non è stata data abbastanza attenzione all importanza del giusto momento in cui effettuare tali aggiunte. Sicuramente nella vinificazione in rosso i principali meccanismi sono gli stessi, anche se la presenza di particelle solide può provocare fenomeni specifici. Sfortunatamente non ci sono a disposizione dati statistici su questo specifico argomento. QUALI SONO LE CONSEGUENZE SULLA QUALITÀ DEL VINO? Le aggiunte di azoto ammoniacale sono normalmente considerate ininfluenti o positive per l aroma del vino. Al contrario molti enologi temono l aggiunta di ossigeno, specialmente vinificando vini bianchi. Tre mosti differenti vennero studiati. La composizione finale dei vini non veniva significativamente influenzata dall aggiunta di 5mg/l di ossigeno. Da notare che l acidità volatile non aumentava in modo significativo e il colore non era influenzato, come risulta dalle misure di densità ottica (42, 52 e 62nm). I vini vennero anche degustati e non furono trovate differenze significative. L effetto di aggiunte eccessive di ossigeno venne provato aggiungendo 5mg/l invece di 5mg/l. Nel caso del Sauvignon, l aggiunta di dosi eccessive di ossigeno ne modificava anche il colore (Tabella 1). Anche le proprietà organolettiche vennero modificate: con assaggio in bicchieri neri le differenze tra tesi trattata con 5 mg/l di ossigeno e controllo sono risultate significative all 1% e al 5% [3]. Tabella 1. Effetto delle aggiunte di ossigeno sul colore del vino. Paragone tra l aggiunta di 5 e di 5mg/l. La fermentazione del mosto di Sauvignon senza aggiunta di ossigeno è il testimone. Testimone Aggiunta di 5mg/l Aggiunta di 5mg/l DO DO DO COME CONTROLLARE L AGGIUNTA DI OSSIGENO? I fabbisogni di ossigeno dei lieviti sono abbastanza conosciuti ma il controllo dell ossigenazione risulta molto impreciso. Alcune considerazioni generali sul controllo dell ossigeno. - Non è necessario misurare in modo accurato la quantità di ossigeno immessa nel mosto in fermentazione, ma è invece interessante fare una stima approssimativa in modo da evitare (i) aggiunte insufficienti e di conseguenza non efficaci e al contrario (ii) aggiunte eccessive che influiscono negativamente sulla qualità del vino. - Il livello di saturazione dell ossigeno dissolto nei mosti è pari a circa 7mg/l. Questa concentrazione è vicina alla quantità di ossigeno richiesta dai lieviti ma, come già detto, l aggiunta di ossigeno è più efficace quando effettuata durante la fermentazione. Misurare la quantità di ossigeno disponibile per i lieviti è difficile perché l ossigeno viene consumato non appena viene aggiunto. In molti casi, la velocità di utilizzo dell ossigeno è più elevata della velocità di trasferimento dell ossigeno; quindi la concentrazione di ossigeno dissolto nel mosto in fermentazione è vicina a zero. - L ossigeno può essere addizionato con le tecniche tradizionali, ma queste tecniche, quali il rimontaggio all aria, sono generalmente mal controllate e non ripetibili. Sarebbe auspicabile che

5 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 5 l aggiunta di ossigeno fosse (i) calibrata (utilizzando una vasca riempita con mosto de-aerato) e (ii) fosse ripetibile. La quantità di ossigeno trasferito con il rimontaggio dipende da molti parametri (grandezza della vasca, la velocità di flusso della pompa...) e non sono disponibili dati di valore generale. Comunque, esperimenti fatti sia su scala industriale che in laboratorio indicano che, in media, la quantità di ossigeno necessario viene immesso facendo un rimontaggio con un volume di mosto pari da una a due volte il volume della vasca. - E possibile ossigenare un mosto facendo gorgogliare o aria o ossigeno puro, ma in entrambi i casi occorre ricordare che i lieviti possono assimilare solo l ossigeno dissolto. La dissoluzione dell ossigeno è massima quando le bolle d aria sono molto piccole e rimangono per un tempo sufficiente nel mosto in fermentazione. La resa di ossigeno trasferito varia tra il 3% e il 1% e dipende dalle caratteristiche della candela porosa, dalla velocità di flusso del gas, dalla grandezza della vasca...(vedi l esempio seguente). Un esempio di misurazione del trasferimento di ossigeno [8] Questa prova venne fatta utilizzando una vasca do 5 l connessa con una candela porosa montata nel circuito di rimontaggio (figura 5). Il trasferimento di ossigeno venne misurato utilizzando due metodi: - Medodo 1: calcolo del coefficiente di trasferimento dell ossigeno (K l a) (figura 6) la velocità di trasferimento dell ossigeno è calcolato utilizzando la formula : r o2 = K l a (C* -C), dove C = concentrazione di ossigeno dissolto (quando C =, r o2 = r o2 max ), C* = concentrazione di saturazione dell ossigeno dissolto. Condizioni del test: temperatura 2 C, C* =34 mg/l, velocità di flusso dell ossigeno = 22.5l/h, volume del mosto = 425 l K l a = 2.2 h -1 r o2 max = 74.8 mg/l h. Osservazione: prima di usare questo metodo, è necessario verificare che non ci sia consumo di ossigeno da parte del mosto. Ln (C*-C) - k L a Time Figura 5. Vasca da 5l. 1: 4: sonde dell ossigeno (nella vasca e nel circuito di rimontaggio), 5: iniettore con candela porosa, 6: pompa, 7: sonda per la temperatura [8] Figura 6. Calcolo del coefficiente di trasferimento dell ossigeno (Kla) nel mosto, prima dell inoculo (metodo 1). - Metodo 2: r O2 = (C 2 -C 1 ) * Q/V, dove C 1 = concentrazione dell ossigeno disciolto nella vasca, C 2 = concentrazione dell ossigeno disciolto nel circuito di rimontaggio (dopo la valvola), Q: velocità del flusso della pompa di circolazione, V: volume del mosto. Questo metodo è più difficile da usare, ma può essere utilizzato durante la fermentazione, quando l ossigeno è consumato dai lieviti.

6 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 6 Aggiungendo ossigeno molte volte durante la fermentazione, abbiamo dimostrato che i valori di r O2 sono (i) costanti in qualsiasi momento della fermentazione e (ii) simili a quelli ottenuti usando il metodo 1. Questi risultati indicano che, nella pratica, è possibile effettuare una stima accurata dell ossigeno immesso durante la fermentazione, misurando il coefficiente di trasferimento dell ossigeno nel mosto prima dell inoculo (metodo 1). E IMPORTANTE LA SCELTA DEL CEPPO DI LIEVITO? Il test su 72 mosti con difficoltà di fermentazione ha evidenziato lievi differenze tra i ceppi (tutti erano buoni fermentatori ). Al contrario, prendendo lo stesso mosto difficile da fermentare e utilizzando ceppi commerciali scelti a caso, senza, cioè, prendere in considerazione il loro potere fermentativo, vennero osservate forti differenze [9]: si osservarono fermentazioni interrotte con 1-56 g/l di zuccheri residui nel caso di 3 ceppi, mentre tutti gli altri ceppi consumavano tutti gli zuccheri, ma con durate di fermentazione variabili tra 119 e 17 ore. Questi risultati dimostrano che la scelta del ceppo di lievito è importante per prevenire i rischi di fermentazioni stentate o interrotte. Figura 7: effetto del ceppo di lievito sulla durata di fermentazione e sulla concentrazione di zuccheri residui Mosto di Chardonnay [9]. D u r a t i o n R e s i d u a l S Fabbisogno di azoto Per poter paragonare il fabbisogno di azoto tra i diversi ceppi di lieviti, ci siamo concentrati sul consumo di azoto durante la fase stazionaria (i) perché questa fase ha un impatto tecnologico importante - in enologia, la maggior parte dello zucchero viene metabolizzato dopo che la crescita si è fermata e (ii) perché l aggiunta di sali di ammonio in questa fase ha almeno la stessa efficacia di quanta ne avrebbe se venisse effettuata nel mosto [4]. Per quantificare l efficacia dell apporto di azoto durante quella fase, abbiamo condotto fermentazioni a velocità costante. Infatti, come già descritto da Manginot et al. [1], la velocità di fermentazione può essere regolata nel corso di quasi tutto lo svolgimento della fermentazione, cioè dal momento in cui la velocità si impenna all inizio della fermentazione fino al momento in cui la concentrazione degli zuccheri residui diventa limitante, con l aggiunta di azoto. Il numero di cellule, così come la velocità specifica di fermentazione rimangono costanti durante la fase di regolazione. La quantità di azoto somministrato è quindi un buon criterio per quantificare l efficacia del tipo di azoto da somministrare durante la fase stazionaria. La curva di azoto apportato era sempre dritta tra 2 e 7 g/l CO 2 (P 2-7 ), ma l inclinazione era diversa a seconda del ceppo di lievito. Come illustrato in figura 8, le inclinazioni variano tra.96 e 2.2 mg di azoto/ g CO 2 emessa. Questo risultato indica che i lieviti enologici hanno un diverso fabbisogno di azoto, soprattutto durante la fase stazionaria. Per valutare l interesse tecnologico nel misurare P 2-7, abbiamo fatto fermentare un mezzo sintetico e numerosi mosti naturali senza aggiungere azoto; quindi abbiamo paragonato la durata delle fermentazioni con i valori di P 2-7. Le fermentazioni con durate più elevate corrispondevano ai valori più alti di P 2-7 e venne trovata una buona correlazione tra questi due parametri.

7 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 7 La valutazione del fabbisogno di azoto è di particolare interesse nel caso di mosti poveri di azoto, perché la durata della fermentazione, in tali condizioni, è correlata alla capacità del lievito di assimilare l azoto in modo efficiente.,8,7 P2-7 (mg N/ g CO2) 2,5 2 1,5 1,5 S4 S13 S26 S25 S7 S9 S6 S1 S24 S17 S14 S23 S16 S15 Figura 8: Differenze del fabbisogno di azoto dei diversi ceppi di lievito [11] V max (g/l.h),6,5,4,3,2,1 S27 S2 S1 S11 S25 S26 S13 S3 S31 S29 S3 S15 S4 S5 S2 Figura 9: Differenze del fabbisogno di ossigeno dei diversi ceppi di lievito [11] S18 Fabbisogno di ossigeno Per paragonare il fabbisogno di ossigeno di diversi ceppi di lieviti, sono state condotte fermentazioni in mosti de-aerati e senza fattori di crescita anaerobica. In queste condizioni, i lieviti erano fortemente limitati dall assenza di ossigeno. La crescita era limitata dalla carenza di ossigeno invece che dall azoto. Di conseguenza, qualsiasi fosse il ceppo di lievito usato, la popolazione cellulare risultava sempre molto poco numerosa. Il valore della velocità massima di produzione di CO 2 ((dco 2 /dt) max ), correlata al massimo della popolazione cellulare, era basso, ma era diverso a seconda del ceppo di lievito (figura 9) e compreso tra.38 e.78 g/l.h. Il potere fermentativo in assenza di ossigeno sembrava essere lievito-dipendente, sicuramente collegato all attitudine delle cellule a utilizzare le riserve lipidiche durante la fase di crescita. Per stimare l interesse tecnologico di queste misurazioni, abbiamo fatto alcuni esperimenti usando mosti naturali. Abbiamo scelto mosti che davano fermentazioni stentate e abbiamo paragonato due ceppi, le cui cinetiche di fermentazione erano diverse in condizioni anaerobiche. La fermentazione era più breve e la vitalità finale delle cellule era più elevata nel caso del ceppo che aveva una minore (dco 2 /dt) max e una popolazione minore. Questo conferma i risultati ottenuti in un mezzo sintetico e indica che valori bassi di (dco 2 /dt) max e popolazioni meno numerose determinano una migliore vitalità delle cellule a fine fermentazione, facendo abbassare il rischio di blocchi fermentativi o di fermentazioni stentate. Infatti, in queste condizioni, bassi valori di (dco 2 /dt) max sono preferibili, sicuramente perché corrispondono a una minore divisione cellulare e quindi a una minore diluizione lipidica, che comporta una migliore vitalità a fine fermentazione. Conclusioni - Le carenze di ossigeno e di azoto non sono gli unici motivi che determinano fermentazioni stentate o arresti fermentativi; sono comunque i principali. - L aggiunta di questi nutrienti viene effettuata da diverso tempo ma non sempre in modo efficace, a causa soprattutto del momento sbagliato in cui viene fatta. Infatti, anche se non sono difficili da effettuare, questi apporti richiedono un minimo di attenzione perché possano servire e per evitare conseguenze negative. Più in generale, altre operazioni di base, quali la reidratazione dei lieviti dovrebbero essere fatte scrupolosamente, ma sicuramente non è sempre così. - Si può diminuire il rischio di fermentazioni stentate o interrotte aumentando la quantità di inoculo o somministrando preparati commerciali che contengono non solo azoto ammoniacale ma anche

8 SABLAYROLLES, COME EVITARE GLI ARRESTI DI FERMENTAZIONE?, PAG. 8 altri nutrienti, come la tiamina, lieviti inattivati...quando si usano questi prodotti, occorre fare attenzione al momento in cui si aggiungono. - La scelta del ceppo di lievito è importante. Nel caso di mosti difficili da fermentare, è preferibile (i) usare ceppi con un buon potere fermentativo o (ii) fare molta attenzione a come si aggiunge l ossigeno e l azoto. Bibliografia 1. Alexandre, H. and Charpentier, C., Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must. J. Ind. Microb. Biotechnol., 2, Bisson, L. F., Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Vitic., 5, Blateyron L. and Sablayrolles J.M., 21. Stuck and slow fermentations in enology : statistical study of causes and effectiveness of combined additions of oxygen and diammonium phosphate. J. Biosc. Bioeng., 91, Bely M., Sablayrolles J.M. and Barre P., 199. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in enological conditions. J. Ferm. Bioeng., 7(4), Lafon-Lafourcade S., Geneix C. and Ribereau Gayon P., Inhibition of alcoholic fermentation of grape musts by fatty acids produced by yeast ghosts. Appl. Environ. Microbiol., Sablayrolles J.M. and Barre P., Evaluation des besoins en oxygène de fermentations alcooliques en conditions oenologiques simulées. Sci. Aliments, 6, Sablayrolles J.M., Dubois C., Manginot C., Roustan J.L. and Barre P., Effectiveness of ammoniacal nitrogen and oxygen combined additions during sluggish and stuck wine fermentations. J. Ferm. Bioeng., 82 (4), Blateyron L., Aguera E., Dubois C., Gerland C. and Sablayrolles J.M., Control of oxygen additions during alcoholic fermentations. Vitic. Enol. Sci., 53(3), Blateyron L., Julien A., Sablayrolles J.M., 2. Stuck fermentations. O2 and nitrogen requirements. Importance of optimizing their addition. Lallemand-Research meeting, Vienne (Autriche), 3-4 mai. 1. Manginot C., Sablayrolles J.M., Roustan J.L., Barre P., Use of constant rate fermentations to compare the effectiveness of different nitrogen sources added during the stationary phase. Enz. Microb. Technol., 2(5), Julien A., Roustan J.L., Dulau L., Sablayrolles J.M., 2. Characterization of enological yeast strains : Evaluation of their nutritive requirements in nitrogen and oxygen. Annual meeting of the American Society of Enology and Viticulture. Seattle (USA), juin.