CELLULE E RADIAZIONI

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Elisa Mariotti
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1 Stage H CELLULE E RADIAZIONI Tutor: Roberto Cherubini, Viviana De Nadal Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda Giora, Marco Pinamonti 1

2 Scopo dell esperienza Studiare la sopravvivenza delle cellule sottoposte a irraggiamento di radiazioni ionizzanti: raggi γ e protoni. Studiare i danni al DNA prodotti da raggi γ. 2

3 Biologia cellulare 3

4 DNA Doppia elica Nucleotidi Desossiribosio Gruppo fosfato Basi azotate PURINE Adenina Guanina PIRIMIDINE Timina Citosina 4

5 Vita cellulare Ciclo mitotico Ciclo cellulare 5

6 Checkpoint 1 G1-S 2 G2-Mitosi 6

7 Radiobiologia Tipi di Radiazioni ionizzanti Direttamente Particelle α, β +, β - Protoni e ioni Indirettamente Raggi X, γ Neutroni Radiazioni indirettamente ionizzanti Radiazioni direttamente ionizzanti 7

8 Radiobiologia Danni radio-indotti: Molecolare Subcellulare Cellulare Tessuto/organo Intero corpo al livello di DNA e RNA alterazione delle strutture subcellulari inibizione divisione cellulare / morte cellulare / cellule tumorali possono portare a morte morte o accorciamento della vita 8

9 I esperienza: Valutazione della sopravvivenza cellulare tramite saggio clonogenico 9

10 Descrizione della I esperienza Si prepara una coltura cellulare 10

11 Colture cellulari Cellule isolate dal loro ambiente naturale e mantenute in un sistema definito Coltura cellulare utilizzata: V79 (fibroblasti di Hamster Cinese) Coltura primaria Linea cellulare Coltura cellulare Colture in monostrato Colture in sospensione 11

12 Mantenimento Parametri chimico fisici: Temperatura -> 37 C % di CO2 e O2 ph -> 7,4 substrato Sostanze nutritive: Terreno di coltura: Terreno di base -> DMEM Additivi -> siero fetale bovino 12

13 Manipolazione Sterilitá Controllo dello stato Microscopi Espansione Subcoltura

14 Descrizione della I esperienza Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi 14

15 Sorgente di Cobalto-60 15

16 Sorgente di Cobalto-60 Caratteristiche: Attività ( ) : 5.8 TBq Energie g : 1.17 MeV e 1.33 MeV T 1/2 : anni Simbolo: Co Rateo di dose: 1 Gy/min; 17.2cm 16

17 Acceleratore CN Linea di fascio di Radiobiologia 17

18 Linea di fascio di Radiobiologia 18

19 Grandezze dosimetriche Dose Efficacia biologica relativa D d dm J/kg, Gy R. B. E. D D RX r SF SF 0 Rateo di dose D dd dt Gy/min SF XR D 0 Trasferimento lineare di energia LET de dx kev/mm SF p 19

20 Grandezze dosimetriche Dose equivalente Dose effettiva H QD Sv E w H T T T Sv Radiazione Fattore di peso Q Tessuto Fattore di peso w T Fotoni ed elettroni Protoni 2 Particelle α e ioni pesanti 1 20 Neutroni Da 2 a 20 Midollo osseo, polmoni, seno 0.12 Gonadi 0.08 Tiroide, fegato, esofago 0.04 Pelle, cervello

21 Descrizione della I esperienza Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose Si lasciano in incubazione per 5 giorni Si procede con il fissaggio e la colorazione dei cloni 21

22 Fissaggio e colorazione Colorante utilizzato: Violetto di Genziana 22

23 Descrizione della I esperienza Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose Si lasciano in incubazione per 5 giorni Si procede con il fissaggio e la colorazione delle popolazioni Si contano le colonie sopravvissute 23

24 Conteggio 24

25 Descrizione della I esperienza Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti radioattive a diverse dosi Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose Si lasciano in incubazione per 5 giorni Si procede con il fissaggio e la colorazione delle popolazioni Si contano le colonie sopravvissute Si analizzano i dati per tracciare la curva di sopravvivenza 25

26 Surviving Fraction (S.F.) Analisi dati RBE 2Gy,g 2.9 RBE 50% 2.6 Raggi-gamma, Co Protoni, 28.5 kev/mm Dose (Gy) 26

27 II esperienza: Valutazione dei danni al DNA mediante Saggio della cometa 27

28 Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ 28

29 Danni al DNA Tipi di danno: Rotture a singolo filamento SSB Rotture a doppio filamento DSB Danno alle basi azotate Perdita di una base Cambiamento di una base Dimeri di pirimidine Cross-link DNA-DNA 29

DNA Mutazioni geniche Aberrazioni Sostituzione

30 Mutazioni Mutazione: Qualsiasi cambiamento che alteri la costituzione chimica o fisica del DNA Mutazioni geniche Aberrazioni Sostituzione Inserzione/ delezione Cromosomiche Cromatidiche 30

31 Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ Procedimento Si irraggia una popolazione di cellule V79 Le cellule vengono separate dal terreno tramite centrifugazione Si aggiungono le cellule al gel di agarosio low melting e si stendono sul vetrino I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a ph 13 per 1h Si procede con l elettroforesi 31

32 Elettroforesi Voltaggio di 25 V Corrente di 300 ma 20 minuti di corsa Sfrutta la carica negativa del DNA Buffer a ph 13 32

33 Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ Procedimento Si irraggia una popolazione di cellule V79 Le cellule vengono separate dal terreno tramite la centrifuga Si seminano le cellule sui vetrini immerse in agarosio low melting I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a ph 13 Si procede con l elettroforesi Colorazione e analisi fotografica delle comete 33

34 Analisi fotografica Colorante utilizzato: DAPI Strumento: microscopio a fluorescenza Controllo 0.5 Gy 3 Gy Coda Testa 34

35 Stage H: cellule e radiazioni Tutor: Roberto Cherubini, Viviana De Nadal Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda Giora, Marco Pinamonti 35

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