ScanGel COOMBS Anti-IgG,-C 3 d Schede Schede
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1 ScanGel COOMBS Anti-IgG,-C 3 d Schede Schede GEL FORMULATI CON UN ANTIGLOBULINA POLISPECIFICA (FRAZIONI POLICLONALE E MONOCLONALE MURINA) Ricerca di Ac irregolari, compatibilità, test diretto con l antiglobulina, fenotipizzazione IVD Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono sottoposti a un sistema di assicurazione qualità dal momento del ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ciascun lotto di prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e viene messo in commercio soltanto se risulta conforme ai criteri di accettazione. Tutta la documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata a cura del fabbricante. 41
2 I - UTILIZZO E PRINCIPIO DEL TEST Questa scheda è strettamente riservata all uso professionale e diagnostico in vitro. Destinato alla ricerca (monitoraggio e identificazione) degli anticorpi antieritrocitari irregolari, alla prova di compatibilità, al test antiglobulinico diretto (Coombs direct) e alla fenotipizzazione eritrocitaria, il test combina i principi di agglutinazione e gel filtrazione. La reazione può essere effettuata e letta in seguito a centrifugazione di microprovette appositamente realizzate, riempite con gel impregnato del reagente antiglobulinico (AHG). La sospensione di globuli rossi e, ove necessario, il siero o il plasma vengono immessi nel pozzetto delle microprovette e centrifugati previo o non (secondo il test) periodo di incubazione. I globuli rossi non agglutinati vengono raccolti sul fondo della microprovetta, mentre gli agglutinati vengono trattenuti nel gel in base alle loro dimensioni. L intensità della reazione è determinata dalla posizione degli agglutinati all interno del gel La capacità del gel di separare i globuli rossi dal siero o dal plasma elimina la fase di lavaggio obbligatoria nelle tecniche convenzionali. II - CARATTERISTICHE DEI REAGENTI Le microprovette della scheda ScanGel COOMBS Anti-IgG,-C3d contiene un gel impregnato di un reagente antiglobulina polispecifica (AHG). La frazione anti-igg viene preparata a partire da sieri di capre iperimmunizzate La frazione anti-complemento è preparata a partire da una miscela di sieri di capre iperimmunizzate con un anticorpo monoclonale murino di specificità anti-c3d prodotto a partire dal clone 053A714. I reagente contiene azide di sodio (< 0,1%) come conservativo. Il codice prodotto e il numero di schede contenute in ogni scatola sono indicati sull etichetta della scatola stessa. III - CONSERVAZIONE - VALIDITÀ La data limite per l utilizzo e le condizioni di conservazione sono indicate sulla scatola. Conservare le schede a temperatura ambiente compresa tra +15 C e +25 C. Le schede devono essere conservate in posizione verticale al riparo da fonti di calore in un luogo a relativa costanza di temperatura e igrometria. 42
3 IV - AVVERTENZE E PRECAUZIONI L affidabilità dei risultati dipende dalla corretta esecuzione delle Buone Pratiche di Laboratorio di seguito riportate : Non utilizzare i reagenti oltre la data di scadenza indicata sull'etichetta. Non utilizzare schede con evidenti segni di essiccazione, bolle o con la linguetta sigillante danneggiata o parzialmente sollevata. È indispensabile prendere precauzioni necessarie per non provocare contaminazioni tra microprovette in particolare al momento nelle fasi della distribuzione. Utilizzare un puntale di pipetta diverso per ogni campione e per ciascun test per globuli rossi. Verificare la precisione e il buon funzionamento delle pipette e degli altri strumenti. Indossare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione dei reagenti e dei campioni. Non pipettare mai direttamente con la bocca. Evitare gli schizzi. In caso di schizzi, pulire con candeggina a 12 Cl diluita a 1/10 e asciugare con carta assorbente. Il materiale utilizzato per pulire dovrà essere gettato in un contenitore per residui contaminati. Consumabili e prodotti che sono stati in contatto con campioni o reagenti contenenti materiali di origine umana devono essere scartati solamente dopo essere stati decontaminati. Su richiesta sono disponibili schede di sicurezza. V - RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Prelevare il sangue in condizioni asettiche in una provetta senza o con anticoagulante (EDTA, CPD). Per il test antiglobulinico diretto (Coombs direct), si raccomanda di utilizzare un prelievo eseguito con anticoagulante (EDTA). Eseguire il test il più presto possibile dopo il prelievo. I campioni che non potranno essere analizzati rapidamente dovranno essere conservati ad una temperatura compresa tra +2 C e +8 C e sottoposti a test nel giro di 48 ore. Per il test antiglobulinico diretto (Coombs direct), i campioni prelevati con provetta asciutta non devono essere testati in seguito a refrigerazione. Accertarsi che non sussistano mai emolisi. Non riscaldare i campioni. VI - TECNICHE Materiale fornito Schede ScanGel COOMBS Anti-IgG,-C3d Altro materiale necessario, ma non fornito ScanLiss : mezzo di sospensione dei globuli rossi ScanLiss 100 ml 43
4 86442 ScanLiss 500 ml IH QC : Controllo sierologico del gruppo sanguigno IH QC 4 x 6 ml Centrifuga : ScanGel Centrifuge Incubatore : ScanGel Incubator Pipette automatiche o semi-automatiche Puntali per pipette Provette mono-uso Recipiente per rifiuti a rischio biologico Candeggina Guanti in lattice Carta assorbente Occhiali di protezione 1. Monitoraggio e identificazione degli anticorpi antieritricitari irregolari Controlli Si raccomanda di eseguire parallelamente a ciascun test un auto-controllo (siero o plasma e globuli rossi del paziente). Controllo positivo (plasma noto contenente almeno un anticorpo identificabile mediante il test antiglobulinico indiretto), e negativo (siero noto, assenza di anticorpi), IH QC : Controllo sierologico del gruppo sanguigno. Reagenti necessari, ma non forniti EryScan, ScanCell, ScanPanel : test per globuli rossi pronti all uso per il monitoraggio e l'identificazione degli anticorpi antieritrocitari irregolari (test antiglobulinico indiretto) EryScan 2 x 10 ml ScanCell 3 x 10 ml ScanPanel 10 x 3 ml Modo operativo Attenersi strettamente al modo operativo. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Separare tramite centrifugazione il siero o il plasma dai globuli rossi del campione da testare. Qualora il sangue venga prelevato in una provetta asciutta, il siero deve essere centrifugato nuevamente a 1500 giri per 10 minuti. 44
5 a) Preparazione di sospensione di globuli rossi quando questi non siano pronti per l uso Auto-controllo : Distribuire 1 ml di ScanLiss in una provetta mono-uso munita di targhetta identificativa. Aggiungere 10 µl dei globuli rossi del campione (autocontrollo). Mescolare. b) Tecnica 1. Contrassegnare ciascuna scheda o parte di scheda (secondo il numero di test per globuli rossi impiegati per il campione) con il nome o il numero campione corrispondente; indicare per ciascuna provetta il test per globuli rossi da distribuire. Staccare tutta la linguetta in alluminio della scheda. Risospendere le emazie prima dell'uso. 2. Immettere 50 µl di ogni sospensione di test per globuli rossi pronti per l uso ScanCell o ScanPanel o della sospensione di globuli rossi preparata come in 1- a) nel pozzetto delle opportune microprovette. 3. Aggiungere immediatamente 25 µl di siero o di plasma nel pozzetto delle microprovette corrispondenti al campione testato. In nessun caso l intervallo tra la distribuzione dei globuli rossi e quella del plasma o del siero deve superare i 10 minuti. 4. Incubare per 15 minuti a +37 C nello ScanGel Incubator. 5. Centrifugare 10 minuti nella ScanGel Centrifuge. 6. Leggere le reazioni. 2. Prova di compatibilità Controlli Controllo positivo (plasma noto contenente almeno un anticorpo identificabile mediante il test antiglobulinico indiretto), e negativo (siero noto, assenza di anticorpi), IH QC : Controllo sierologico del gruppo sanguigno. Modo operativo Attenersi strettamente al modo operativo. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Separare tramite centrifugazione il siero o il plasma dei globuli rossi del campione da testare. Qualora il sangue venga prelevato in una provetta asciutta, il siero deve essere centrifugato nuovamentea 1500 giri per 10 minuti. 45
6 a) Preparazione della (delle) sospensione(i) di globuli rossi (donatore(i)) Per ciascun donatore : Distribuire 1 ml di ScanLiss in una provetta mono-uso munita di targhetta identificativa. Aggiungere 10 µl di sedimento globulare (globuli rossi del donatore). Mescolare. La sospensione di globuli rossi è pronta per l uso. b) Tecnica 1. Contrassegnare ogni scheda o parte di scheda con il nome o il numero del ricevente e il numero del o dei donatori corrispondenti. Staccare tutta la linguetta in alluminio della scheda. Risospendere le emazie prima dell'uso. 2. Immettere 50 µl di ogni sospensione di globuli rossi nel pozzetto delle opportune microprovette. 3. Aggiungere immediatamente 25 µl di siero o di plasma del ricevente nel pozzetto delle opportune microprovette. In nessun caso l intervallo tra la distribuzione della sospensione di globuli rossi e quella del siero o del plasma deve superare i 10 minuti. 4. Incubare per 15 minuti a +37 C nello ScanGel Incubator. 5. Centrifugare 10 minuti nella ScanGel Centrifuge. 6. Leggere le reazioni. 3. Test antiglobulinico diretto (Coombs test) Controlli Controllo positivo (globuli rossi sensibilizzati mediante un anticorpo di natura IgG noto e/o mediante la frazione C3d del complemento) e negativo (globuli rossi non sensibilizzati). Modo operativo Attenersi strettamente al modo operativo. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Separare tramite centrifugazione il siero o il plasma dei globuli rossi del campione da testare. a) Preparazione di sospensione di globuli rossi Per ogni campione : Distribuire 1 ml di ScanLiss in una provetta mono-uso munita di targhetta identificativa. Aggiungere 10 µl di sedimento globulare del campione. Mescolare. La sospensione di globuli rossi è pronta per l uso. 46
7 b) Tecnica 1. Identificare la scheda con il nome o il numero del campione corrispondente. Staccare tutta la linguetta in alluminio della scheda. Risospendere le emazie prima dell'uso. 2. Immettere 50 µl di ciascuna sospensione di globuli rossi nel pozzetto delle opportune microprovette. 3. Centrifugare immediatamente 10 minuti nella ScanGel Centrifuge. Il ritardo tra la fine della distribuzione e l'inizio della centrifugazione non deve eccedere 10 minuti. 4. Leggere le reazioni. 4. Fenotipizzazione eritrocitaria Controlli Campioni positivo e negativo : globuli rossi riconosciuti positivi e negativi per l antigene, testati contemporaneamente ai globuli rossi del campione, IH QC : Controllo sierologico del gruppo sanguigno. Controllo campione (esclusivamente globuli rossi del campione). Reagente necessario, ma non fornito Reagenti Bio-Rad corrispondente all antigene studiato. Modo operativo Attenersi strettamente al modo operativo. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Separare tramite centrifugazione il plasma dei globuli rossi del campione da testare. a) Preparazione di sospensione di globuli rossi Per ogni campione : Distribuire 1 ml di ScanLiss in una provetta mono-uso munita di targhetta identificativa. Aggiungere 10 µl di sedimento globulare del campione. Mescolare. La sospensione di globuli rossi è pronta per l uso. b) Tecnica 1. Per ciascun campione, contrassegnare una microprovetta con il nome o il numero campione corrispondente e l identificatore del test per siero, e una microprovetta con il nome o il numero campione (controllo campione). Staccare tutta la linguetta in alluminio della scheda. Risospendere le emazie prima dell'uso. 2. Immettere 50 µl di ogni sospensione di globuli rossi nel pozzetto delle opportune microprovette. 47
8 3. Aggiungere immediatamente 25 µl di test per siero nel pozzetto delle opportune microprovette (ad eccezione delle microprovette utilizzate come controllo del campione). In nessun caso l intervallo tra la distribuzione dei globuli rossi e quella del test per siero deve superare i 10 minuti. 4. Incubare per 15 minuti a +37 C nello ScanGel Incubator. 5. Centrifugare 10 minuti nella ScanGel Centrifuge. 6. Leggere le reazioni. VII - RISULTATI E INTERPRETAZIONE La presenza di agglutinati (in superficie o dispersi nel gel) o di un emolisi in una microprovetta corrisponde a un risultato positivo. Un sedimento di globuli rossi depositatisi sul fondo della microprovetta e l assenza di emolisi corrisponde a un risultato negativo. I risultati sono validi soltanto se i controlli positivo e negativo danno i risultati attesi. 1. Monitoraggio e identificazione degli anticorpi antieritricitari irregolari Un risultato negativo (assenza di agglutinazione e di emolisi) in ciascuna delle microprovette utilizzate indica che il siero o il plasma testati non contengono l anticorpo, corrispondente agli antigeni presenti sul test per globuli rossi, identificabile mediante la tecnica adottata. Un risultato positivo (agglutinazione e/o emolisi) in una delle microprovette utilizzate dimostra al contrario la presenza di uno o più anticorpi nel siero o nel plasma. Si dovrà pertanto effettuare l identificazione di detto(detti) anticorpo(i). Un risultato positivo nella microprovetta auto-controllo può indicare la presenza di un auto-anticorpo. Se oltre all auto-controllo, almeno uno dei test per globuli rossi risulta agglutinato, si dovrà prevedere una miscela auto-anticorpo/allo-anticorpo. È possibile individuare soltanto gli anticorpi corrispondenti agli antigeni presenti sui test per globuli rossi. Per quanto riguarda l identificazione, l analisi comparata tra le reazioni positive e le reazioni negative osservate con ciascuno dei test per globuli rossi del panel utilizzato permette di caratterizzare, mediante la scheda di analisi allegata al panel, la o le specificità degli anticorpi presenti nel siero (o plasma) testati. 2. Prova di compatibilità Un risultato positivo (agglutinazione e/o emolisi) dimostra la presenza di incompatibilità tra il siero o il plasma del ricevente e i globuli rossi del donatore. 48
9 3. Test antiglobulinico diretto (Coombs test) Un risultato negativo indica l assenza di IgG e del complemento sui globuli rossi testati. Un risultato positivo indica la presenza di IgG, del complemento o di entrambi sui globuli rossi testati. 4. Fenotipizzazione eritrocitaria Vedere il foglietto illustrativo del test per siero utilizzato. I risultati sono validi soltanto se il controllo campione è negativo. VIII - PERFORMANCE 1. Monitoraggio e identificazione degli anticorpi antieritricitari irregolari La valutazione delle performance effettuata su 2516 campioni (1782 pazienti e 734 donatori) ha messo in evidenza una reazione equilibrata tra sensibilità e specificità). Ciascun risultato è stato messo a confronto con quello ottenuto con tecniche che immunoaderenza o filtrazione tramite gel. L'applicazione rende possibile la determinazione di anti-rh1(d) umane aventi concentrazione eguale a 20 ng/ml. La specificità su un campione di pazienti non selezionati è pari al 99,8%. Quanto alla riproducibilità dell applicazione, il test ha dato buoni risultati sia intra dosaggio sia inter dosaggio. 2. Prova di compatibilità La valutazione delle performance ha dato risultati concordi con il reagente di riferimento. Ciascun risultato è stato messo a confronto con quello ottenuto con tecniche che utilizzano filtrazione tramite gel. Quanto alla riproducibilità dell applicazione, il test ha dato buoni risultati sia intra dosaggio sia inter dosaggio. 3. Test antiglobulinico diretto (Coombs test) La valutazione delle performance è stata effettuata su 147 campioni (neonati e campioni provenienti da malati ospedalizzati con sospetta anemia emolitica auto-immune). Ciascun risultato è stato messo a confronto con quello ottenuto con tecniche che utilizzano provette o filtrazione tramite gel. I risultati ottenuti non hanno evidenziato nessuna discrepanza con la tecnica mediante gel utilizzata in parallelo. Quanto alla riproducibilità dell applicazione, il test ha dato buoni risultati sia intra dosaggio sia inter dosaggio. 49
10 4. Fenotipizzazione eritrocitaria Vedere il foglietto illustrativo del test per siero utilizzato. LIMITI Risultati anomali possono essere causati da : contaminazione batterica o chimica del siero, del plasma, dei globuli rossi o del materiale. presenza di medicazioni o stato patologico del paziente che abbiano scatenato una reazione incrociata. utilizzo di un mezzo di sospensione dei globuli rossi diverso da quello raccomandato. rimessa in sospensione incompleta dei globuli rossi. preparazione di globuli rossi diversa da quella raccomandata. emolisi dei campioni o dei globuli rossi del test. presenza di fibrina (immagine di un sedimento cellulare compatto sul fondo di una microprovetta accompagnato da una sottile striscia rosa nella parte alta del gel corrispondente ai globuli rossi trattenuti dai residui di fibrina). contaminazione tra microcolonne. uso di altre procedure rispetto a quella sopra descritta. Su licenza DiaMed SA, 1785 Cressier-sur-Morat, Svizzera 50
11 10 IX - LITERATURE 1. Löw B, Messeter L. Antiglobulin test in low-ionic strength salt solution for rapid antibody screening and cross-matching. Vox Sang. 1974; 26: Kankura T, Kurashina S, Nakao M. A gel filtration technique for separation of erythrocytes from human blood. J Lab Clin Med 1974; 83: Rouger Ph, Salmon Ch.: La pratique de l'agglutination des érythrocytes et du test de Coombs. Masson ISBT/ICSH Working Party : International Reference Polyspecific AntiHuman Globulin Reagents. Engelfriet CP, Voak D. Vox Sang.1987; 53: Engelfriet C.P., Overbeeke MAM, Voak D : the antiglobulin test (Coombs test) and the red cell ; In Cash, Progress in Transfusion Medecine. Churchill Livingstone. 1987; vol2: Voak D.: Coordinated report of studies on monoclonal antibodies to complement. Rev. Fr. Transf. Immunhematolol. 1988;XXXI, Voak D, Downie D.N. : Serological characterisation of monoclonal antibodies to complement components of C3 and C4. Rev. Fr. Transf. Immunohematol. 1988;XXXI, Lapierre Y, Rigal D, Adam J et al : The gel test : a new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 1990;30: Proceedings of the second international workshop and symposium on monoclonal antibodies against human red blood cells and related antigens. IgG/Complement. Lund. 1990; Bromilov IM, Adams KE, Hope J, Eggington JA and Duguid JKM. Evaluation of the ID-gel test for antibody screening and identification. Transfusion Medecine 1991;1: Salmon Ch, Cartron JP, Rouger Ph.: Les groupes sanguins chez l'homme. 2é ed. Masson Pottier C, Quillet P, Baufine-Ducroq H.: Gel-test : Interpretation and value of a new technique for the detection of irregular antibodies. Ann Bio Clin 1992;50: Deffune E, Le Pennec P.Y., Lascaux J.M., Rouger Ph.: Méthode d'étude des réactifs anti-complément : utilisation d'hématies sensibilisées congelées/décongelées. Rev. Fr. Transfu. Hémobiol. 1992;35: Burin des Rosiers N, Nasr O.: Recherche des anticorps irréguliers érythrocytaires par la méthode du gel-test. Analyse de échantillons. Rev. Fr. Transfus. Hemobiol., 1993;36: International Forum. What is the best technique for the detection of red cell alloantibodies. Vox Sang 1995;69: Issitt P.D.: Applied blood group serology. 4th ed. Miami: Montgomery Scientific Publications, 1998.
12 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code:
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