Tecnologia del DNA ricombinante

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Fabriciano Nobile
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1 Tecnologia del DNA ricombinante Scoperte rivoluzionarie che hanno permesso lo studio del genoma e della funzione dei singoli geni Implicazioni enormi nel progresso della medicina: comprensione malattie e possibilità terapeutiche Ingegneria genetica in campo alimentare Ingegneria genetica in medicina forense Ingegneria genetica nella nostra vita quotidiana: proteasi purificate e contenute in saponi liquidi da bucato

2 Tecnologia del DNA ricombinante Genoma cellule Eucariotiche (umane) 3x10 9 paia di basi Genoma di batterio E coli comunque lungo 4,6 x 10 6 paia di basi: anche per isolare geni da batteri c è una difficoltà notevole nel separare un singolo gene dal resto del genoma Una scoperta rivoluzionaria sono state le NUCLEASI BATTERICHE, una classe di enzimi batterici che taglia il DNA a doppio filamento riconoscendo delle piccole specifiche sequenze nel DNA stesso. Alcuni ricercatori stavano studiando come mai un DNA introdotto in una cellula batterica venisse riconosciuto come esogeno e tagliato cioè degradato, digerito Scoprirono che cellule batteriche producono nucleasi che riconoscono specifiche sequenze di DNA e che tagliano in punti specifici. Il DNA endogeno del batterio è invece protetto perché è modificato chimicamente, per esempio metilato nelle stesse sequenze. ENZIMI di RESTRIZIONE.

Tecnologia del DNA ricombinante ENZIMI DI RESTRIZIONE Ogni enzima taglierà la sequenza TOT volte nel genoma a seconda di quante volte essa è presente generando frammenti di lunghezza diversa a

3 Tecnologia del DNA ricombinante ENZIMI DI RESTRIZIONE Ogni enzima taglierà la sequenza TOT volte nel genoma a seconda di quante volte essa è presente generando frammenti di lunghezza diversa a seconda della posizione dei siti di taglio nel genoma Ogni genoma per esempio umano avrà lo stesso numero di siti di taglio e frammenti Ad eccezione dei Restriction fragment length polymorphisms (RFLP), siti variabili che comportano perdita o acquisto di siti di restrizione nel genoma

Tecnologia del DNA ricombinante ELETTROFORESI DEL DNA DNA marcato con colorante che si lega etidio bromuro e che diventa fluorescente sotto la luce UV I frammenti migrano al polo positivo a seconda

4 Tecnologia del DNA ricombinante ELETTROFORESI DEL DNA DNA marcato con colorante che si lega etidio bromuro e che diventa fluorescente sotto la luce UV I frammenti migrano al polo positivo a seconda delle maglie del gel cioè della loro grandezza Vedo i frammenti ma non so a cosa esattamente corrispondano. Come si fa per dire quale è il frammento di interesse? Che sequenza di DNA contiene? A che porzione del genoma corrisponde?

5 Mediante utilizzo di porzioni-frammenti di DNA a sequenza nota opportunamente MARCATI che riconoscono frammenti più grandi a cui si legano mediante IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

20 Figure 10-5 (part 2 of 5) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

21 Figure 10-5 (part 3 of 5) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

22 Figure 10-5 (part 4 of 5) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

23 Figure 10-5 (part 5 of 5) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

24 Tecnologia del DNA ricombinante Tramite gli enzimi di restrizione una molecola di DNA a frammento può essere fisicamente isolata non solo identificata come abbiamo visto prima. Può essere anche fusa con un altra molecola frammento a generare il DNA ricombinante cioè non presenti in natura in quella esatta sequenza nucleotidica. La fusione si realizza attraverso DNA ligasi che sono gli stessi enzimi che partecipano alla replicazione o riparazione del DNA. I DNA cosiddetti ricombinanti vengono inseriti in molecole di DNA circolare che funzionano da trasportatori e amplificatori, i VETTORI

25 Tecnologia del DNA ricombinante CLONAGGIO

26 Tecnologia del DNA ricombinante Vettori plasmidici Contengono una origine di replicazione e siti di restrizione noti Sono versioni ingegnerizzate di plasmidi circolari (DNA) di cui si dotano i batteri per trasportare informazione genetica da una cellula all altra

Tecnologia del DNA ricombinante Vettori plasmidici e trasformazione Trasformazione batterica è l inserimento di un frammento di DNA in un plasmide batterico (CLONAGGIO) e l introduzione del plasmide

27 Tecnologia del DNA ricombinante Vettori plasmidici e trasformazione Trasformazione batterica è l inserimento di un frammento di DNA in un plasmide batterico (CLONAGGIO) e l introduzione del plasmide ricombinante nella cellula batterica In questo modo il frammento incluso il plasmide vettore vengono amplificati, cioè aumentano il numero di copie sfruttando la proliferazione del batterio in un mezzo di coltura ricco di nutrienti

28 Tecnologia del DNA ricombinante Vettori plasmidici e librerie genomiche

29 Tecnologia del DNA ricombinante Vettori plasmidici e librerie cdna

31 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction Serve per identificare e amplificare regioni di DNA da: Genoma intero DNA frammento clonato in vettore Reazione in provetta ed è necessaria una quantità minima in nanogrammi di DNA anche genomico di partenza

32 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction

33 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction

34 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction Applicazioni esempi 1- Creare librerie genomiche o di cdna di frammenti prodotti da PCR anzicchè da restrizione enzimatica del DNA 2- Diagnostica: riconoscere presenza di genomi esogeni-patogeni, per es. virali 3- Analisi di polimorfismi

36 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction Identificare DNA patogeno virale

37 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction Identificare DNA umano POLIMORFISMI

41 Human genetic markers

42 Hypervariable Sequences - VNTRs - Minisatellites Esempio di un VNTR ad un solo locus, posizione fisica Su un cromosoma: 4 alleli (sui due cromosomi omologhi) bp repeat 5-50 repetitions

43 Hypervariable Sequences - VNTRs - Microsatellites

45 Tecnologia del DNA ricombinante PCR: polymerasechain reaction STR=single tandem repeat 1 locus, 2 cromosomi omologhi Identificare DNA umano POLIMORFISMI

46 STR=single tandem repeat 3 loci, 3 cromosomi omologhi

47 MAPPATURA GENETICA, analisi di polimorfismi che segregano con gene malattia

48 Tecnologia del DNA ricombinante Sequenziamento del DNA

49 Tecnologia del DNA ricombinante Sequenziamento del DNA

50 Tecnologia del DNA ricombinante Sequenziamento del DNA

51 Come si fa a studiare l impatto di una mutazione in una proteina Funzione biologica Clonaggio in vettori batterici ed purifica di proteina umana e mutante ricombinante Clonaggio in vettori eucariotici e espressione in linee cellulari di proteine umane e ricombinanti Modelli animali Studi di espressione: mrna, ibridazione in situ, RT-PCR Studi espressione a livello di proteina: immunoistochimica

52 Come si fa a studiare la funzione di una proteina mutata

53 Come si fa a studiare la funzione di una proteina mutata

54 Gene targeting to create mouse models

55 Figure (part 1 of 2) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

56 Figure (part 2 of 2) Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

57 Figure Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

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