Basi Teoriche e Applicazioni delle Nuove Tecnologie Genomiche

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1 Corsi di laurea magistrale in: Biotecnologie agrarie e ambientali (LM-7) Biologia cellulare e molecolare (LM-6) Sicurezza e qualitàagroalimentare (LM-69 & LM-70) insegnamento di Basi Teoriche e Applicazioni delle Nuove Tecnologie Genomiche Aula 16 Orario, venerdi 8:50-11:20 Silvia Bongiorni: tel.: bongiorni@unitus.it recapito: DIBAF stanza 23A (seminterrato ex facoltà agraria)

2 GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICAFUNZIONALE: 1. Anatomia dei genomi 8. Funzionamento dei genomi Il genoma dei procarioti Modificazioni della cromatina e l espressione del genoma Il genoma degli eucarioti Microarray e RNA-seq 2. La mappatura dei genomi Metil-seq Mappatura genetica Chip-seq Mappatura fisica 3. Il sequenziamento automatico del DNA Il principio del sequenziamento secondo Sanger Il sequenziamento su larga scala La lettura dei tracciati di sequenziamento 4. Il sequenziamento del genoma I nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento gerarchico Il sequenziamento shogun Piattaforme di sequenziamento di interi genomi La verifica delle sequenze e assemblaggio dei contig 5. L annotazione del genoma Il sequenziamento delle EST Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche 6. I Progetti Genoma Il Progetto Genoma Umano Il Progetto Genoma Animali Il Progetto Genoma Piante Il Progetto Genoma Microrganismi 7. Genotipizzazione Gli SNP e la variazione La genotipizzazione degli SNP

3 Il GENOMAèl insieme di tutti i geni di un organismo. L insieme di tutte le sequenze nucleotidiche codificanti e non di un organismo. La sequenza completa del suo DNA La scienza dei genomi, la GENOMICA è lo studio della struttura, del contenuto e dell evoluzione dei genomi La genomica non è più limitata alla determinazione delle sequenze ma si estende anche all analisi dell espressione e delle funzioni dei geni e delle proteine Le analisi sperimentali sono integrate strettamente da Bioinformatica Biologia computazionale

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5 GENOMICA STRUTTURALE: 1.Anatomia dei genomi Il genoma dei procarioti Il genoma degli eucarioti

6 Organismo Numero bp Numero di geni ΦX-174 Mycoplasma pneumoniae Helicobacter pylori Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Homo sapiens (1,66 Mb) (4,64 Mb) (12,5 Mb) (100 Mb) (122,6 Mb) 3,3 x 10 9 (3289 Mb o 3,3 Gb)

7 Il genoma dei procarioti DNA batterico DNA plasmidico

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9 Il genoma degli eucarioti

10 1,70m in 10µm 146bp Compattazione della cromatina 54bp 2-6 µm

11 genoma cromosoma gene regione intergenica gene

12 Perché alcuni genomi sono così grandi? La quantitàdi DNA contenuta nel genoma aploide èuna caratteristica propria di ciascuna specie vivente ed èdefinita come valore C Il valore C varia enormemente da <10 6 bpper un micoplasma a >10 11 bpper anfibi ed alcune piante La dimensione del genoma cresce con la complessitàdell organismo. Ma in alcuni gruppi c èun enorme variabilitànel contenuto di DNA di specie simili fra loro Il paradosso del valore Csi riferisce alla mancanza di correlazione tra le dimensioni del genoma e la complessità biologica

13 I genomi eucarioticicontengono sia sequenze uniche che DNA ripetuto Il DNA non ripetutoèformato da sequenze uniche: una copia nel genoma aploide Il DNA ripetutoèformato da sequenze che sono presenti in più copie nel genoma aploide DNA moderatamente ripetuto (sequenze >100bp ripetute tra le 10 e le 1000 volte) DNA altamente ripetuto (sequenze <100bp ripetute migliaia di volte)

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15 Quanti geni ci sono nei vari genomi? Organismo Numero bp Numero di geni (% codificante) ΦX-174 Mycoplasma pneumoniae Helicobacter pylori Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Homo sapiens (4,64 Mb) (12,5 Mb) (100 Mb) (122,6 MMb) 3,3 x 10 9 (3289 Mb) (88) 5770 (70) (1,3)

16 non-coding DNA

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18 Junk-DNA

19 Junk-DNA: ruolo nel sileziamento genico Silenziamentopost-trascrizionaledi geni attivi: ad opera dimicro-rna (mirna) e small interfering RNA (sirna)(21-23bp) complementari mirnae sirnalegano l mrnacomplementare, richiamano il complesso RISC e degradano l mrna Junk-DNA: ruolo nell evoluzione geni umani vs gene di scimpanzè: differiscono dello 0,1% del genoma (circa 20 geni) differenze nelle regioninon-codingsono40volte superiori (4%) il ncdnapuò fare la differenza tra uomo e scimpanzè

20 Qual èla funzione dei vari geni?

21 Struttura dei geni esone exon introne intron expressed region intervening region

22 Splicing

23 Splicing alternativo A B C D E F mrna 1 mrna 2 mrna 3 mrna 4 A B C D E F A B C E A B C A B C D F F F AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA

24 Analisi di sequenze genomiche Gli introni sono abbondanti 94% uomo, 85% moscerini, 95% nematode, 95% piante Genoma umano(25000 geni) solo 2-5volte piùgenidel moscerino(13472) o del nematode (19099) Lo splicing alternativo è frequente ~ il 75% dei geni umani trascritti subiscono splicing alternativo

25 Geni sovrapposti Alcune sequenze di DNA codificano per più proteine

26 GENOMICA STRUTTURALE: 2. La mappatura dei genomi Mappatura genetica Mappatura fisica

27 Le mappe indicano la localizzazione delle cose in relazione ad altre cose Le mappe genomiche rivelano l organizzazione del materiale ereditario e possono essere suddivise in 2 tipi: 1. Mappe genetiche: posizionano i geni sui cromosomi sulla base della frequenza di ricombinazione 2. Mappe fisiche: usano marcatori all interno della sequenza, che vanno dai siti di restrizione all analisi diretta del DNA genomico

28 MappeGenetiche descrivono l ordine relativo dei marcatori genetici nei gruppi di associazione o LINKAGE Marcatori= brevi sequenze ripetute di DNA (microsatelliti, Short Tandem Repeats), polimorfismi (Single Nucleotide Polymorphism), siti di restrizione, loci genici Le mappe genetiche sono costruite partendo dai dati di segregazionedei marcatori e dalla loro frequenza di ricombinazione nella progenie perciò la distanza tra marcatori èespressa in centi-morgan(cm), unitàdi misura della frequenza di ricombinazione 1cM = frequenza di ricombinazione dell 1% (circa 1000bp nell uomo, 2000bp nel topo) Per fare una mappa genetica o di associazione (linkage) non necessariamente serve conoscere la sequenza Limiti: 1. la distanza genetica non corrisponde direttamente alla distanza fisica (eu/eterocromatina, sequenze ripetute) 2. non tutti i geni hanno un fenotipo ovvio

29 MappeGenetiche MAPMAKER A program for genetic linkage analysis MAPMAKER/EXP was developed to be a linkage analysis package designed to help construct primary linkage maps of markers segregating in experimental crosses MAPMAKER/QTL is a companion program to MAPMAKER/EXP which allows one to map genes controlling polygenic quantitative traits in F2 intercrosses and BC1 backcrosses relative to a genetic linkage map. More information on MAPMAKER/QTL can be found in the technical report.

30 èuna costellazione di frammenti di DNA sovrapposti, ordinati e orientati, che coprono ciascun cromosoma di un genoma. MappeFisiche Le mappe fisiche sono basate sull analisi diretta del DNA genomico ed indicano l effettivo numero di coppie di basi (bp), kilobasi (kb) o megabasi (Mb) che separano un marcatore (locus) da quello adiacente. Ci sono diverse strategie per allineare i contig: Ibridazione (chromosome walking) Sequenziamentodelle estremità(sts, sequence-taggedsites) Profili di restrizione

31 MappeFisiche Nello sviluppare una mappa fisica dell intero genoma è importante considerare la lunghezza degli inserti dei cloni e l ordine dei cloni lungo il genoma La costruzione delle mappe fisiche di interi genomi, cioèl assemblaggio di tratti contigui (contigs) di DNA cromosomico sarà discusso più avanti

32 La mappaturadeigenomi Le mappe genetiche e fisiche possono essere correlate Qualsiasi gene clonato può essere mappato geneticamente e posizionato fisicamente nel genoma IL METODO PRINCIPALE PER ALLINEARE TRA LORO MAPPE GENETICHEE MAPPE FISICHE E RAPPRESENTATO DALLE MAPPE CITOLOGICHE

33 MappeCromosomiche bandeggio Ibridazione in situ

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36 Le Mappe Tutti i dati di sequenza, ricombinazione derivanti da queste mappe sono immagazzinati in banche dati (database) The National Center for Biotechnology Information The European Molecular Biology Laboratory DNA Data BankofJapan