FUNZIONI DEL DNA E FLUSSO DELL INFORMAZIONE GENETICA. 2. Trasmissione dell informazione genetica dal gene alla proteina

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1 FUNZIONI DEL DNA E FLUSSO DELL INFORMAZIONE GENETICA 2. Trasmissione dell informazione genetica dal gene alla proteina

2 LA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI E NEGLI EUCARIOTI PROCARIOTI EUCARIOTI

3 LA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI E NEGLI EUCARIOTI Filamento stampo Filamento senso Filamento senso di RNA

4 LA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI E NEGLI EUCARIOTI La sintesi di RNA sulla elica stampo del DNA è catalizzata dall enzima RNA polimerasi

5 LA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI La sintesi delle proteine avviene sugli mrna (ad opera di più ribosomi) mentre l mrna si sta ancora sintetizzando.

6 LA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI L RNA polimerasi dei Procarioti sintetizza: gli RNA messaggeri mrna gli RNA transfert trna e gli RNA ribosomali rrna Nei batteri (per es. in E. coli) la RNA polimerasi è costituita da 4 subunità del nucleo enzimatico e un fattore sigma ( ) dissociabile. Il fattore sigma agisce nel riconoscimento del promotore e viene rilasciato con l allungamento dell RNA.

7 Il Promotore dei Procarioti L RNA polimerasi si lega alla sequenza -35 del promotore ed inizia lo svolgimento dei filamenti di DNA nella sequenza -10 La struttura di un promotore tipico di E. coli: La sequenza a -10 TATAAT è chiamata Pribnow box La trascrizione comincia nella bolla di trascrizione in un sito da cinque a nove paia di basi oltre la sequenza a -10.

8 LE FASI DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

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10 LA TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE La terminazione delle catene di RNA nei procarioti avviene quando l RNA polimerasi incontra un segnale di terminazione. Questi segnali sono sequenze specifiche che possono ripiegarsi assumendo una struttura detta a forcina che causa la terminazione della trascrizione (terminatori rhoindipendenti) oppure possono ripiegarsi e interagire con una proteina rho determinando la fine della trascrizione (terminatori rho-dipendenti). Successivamente si ha il distacco dell RNA.

11 LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Cinque tipi di RNA trascritti negli EUCARIOTI: mrna > RNA messaggero, trasporta l informazione genetica nel citoplasma per la sintesi delle proteine trna > RNA transfer, specifici per i vari aminoacidi, per la sintesi proteica rrna > RNA ribosomale, componente dei ribosomi, per la sintesi proteica snrna > (small nuclear RNA) piccoli RNA nucleari, per lo splicing dei messaggeri mirna (micro RNA) altri piccoli RNA nucleari, per la regolazione post trascrizionale Le RNA polimerasi degli EUCARIOTI sono tre Enzima Localizzazione Prodotti RNA polimerasi I Nucleolo rrna 28S (25S), 18S e 5,8S RNA polimerasi II Nucleo mrna, alcuni snrna, mirna RNA polimerasi III Nucleo trna, rrna 5S, alcuni snrna

12 INIZIO DELLA TRASCRIZIONE di un gene eucariotico L RNA pol II non riconosce il promotore senza l intervento dei Fattori di Trascrizione TFII TFIID (Transcription Factor II D) si lega al TATA box del promotore seguono gli altri fattori di trascrizione A, B e F la RNA polimerasi II TFIIE si lega per ultimo Si forma il complesso di inizio della trascrizione La doppia elica di DNA si apre per l azione di TFIIF

13 FASE DI ALLUNGAMENTO interviene un altro fattore di trascrizione TFII S e vengono rilasciati il B e F ( i TFII D e A rimangono legati al promotore per facilitare l attacco di una nuova RNApol II) La RNA pol II catalizza la formazione del legame fosfodiesterico tra il 5 P del ribonucleotide trifosfato da inserire e il 3 OH dell ultimo ribonucleotide inserito Il filamento di RNA cresce in direzione 5 3

14 LA TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE La terminazione della trascrizione NON avviene per arresto della trscrizione in corrispondenza di specifiche sequenze dette Terminatori come nei Procarioti Intervengono una endonucleasi e una esonucleasi specifiche Quando la esonucleasi raggiunge la RNApol II la trascrizione si ferma

15 PROCARIOTI IL GENE CONTINUO EUCARIOTI IL GENE DISCONTINUO

16 PROPRIETA CHIMICO-FISICHE DEL DNA Denaturazione del DNA Riassociazione del DNA Queste proprietà del DNA sono state sfruttate nei primi studi di caratterizzazione del genoma e oggi sono alla base di tutte le moderne tecniche di biologia molecolare come l ibridazione molecolare su filtro, l ibridazione in situ, la PCR ecc.

17 STRUTTURA DEL GENE EUCARIOTICO Chambon e coll, 1978 Fotografia al microscopio elettronico dell ibrido fra mrna e gene per l ovoalbumina di pollo Interpretazione Gene per l ovoalbumina di pollo in verde gli 8 esoni L, 1-7, che formano l ibrdo DNA mrna e i 7 introni A-G, (da 251 a 1600 pb), che non si ibridano con l RNA

18 Gene codificante l ovoalbumina di pollo

19 LE SEQUENZE NEL SITO DI GIUNZIONE ESONE INTRONE SONO CONSERVATE

20 STRUTTURA GENERALE DEL GENE EUCARIOTICO Darnell: un gene è costituito da tutte le sequenze di acido nucleico (di solito DNA) che sono necessarie alla produzione finale di un polipeptide o di un RNA comprende quindi le sequenze promotrici che ne regolano l espressione

21 Una volta chiarita la struttura del gene eucariotico la domanda era: gli introni non si ritrovano nell mrna perché non vengono trascritti oppure vengono trascritti e poi rimossi? Elenco dei partecipanti alla esercitazione

22 TRASCRIZIONE E MATURAZIONE DELL RNA MESSAGGERO NEGLI EUCARIOTI L RNA messaggero è sintetizzato dalla RNApol II nel nucleo e poi trasportato nel citoplasma Gli RNA trascritti sono monogenici Gli mrna prima del trasporto nel citoplasma subiscono tre modifiche principali: (a) aggiunta all estremità 5 di un cappuccio (cap) di 7-metil guanosina; (b) aggiunta all estremità 3 di una coda di poli-a; (c) quando presenti, le sequenze introniche vengono rimosse tramite splicing.

23 Il cap in 5 è importante per l inizio della traduzione e sembra in grado di proteggere l mrna dalla degradazione (Buchanan) La coda di polia viene sintetizzata dalla PoliAPolimerasi in 3 a valle della sequenza AAUAAA (dopo il taglio fatto da una endonucleasi che con la PAP e altre 4 proteine forma un complesso multipro) La coda di polia ( A) facilita il trasporto dell mrna nel citoplasma e lo stabilizza L RNA messaggero immaturo contiene le sequenze corrispondenti agli introni che poi vengono rimosse

24 MECCANISMO DI SPLICING DEI PRE-mRNA : TAGLIA E CUCI SPLICEOSOMA o Complesso di splicing è costituito da proteine associate a piccoli RNA detti snrna (small nuclear RNA) U1, U2, U4, U5, U6 Il primo taglio avviene al 5 dell introne U2 si lega alla sequenza di ramificazione UACUUAUCC che forma la struttura a con l estremità 5 dell introne GU cappio Si forma un legame fosfodiesterico anomalo G-A L estremità 3 dell introne viene tagliata e i due esoni congiunti

25 GLI mrna MATURI CONTENGONO LA 5 UTR e LA 3 UTR La sequenza guida o 5 UTR serve per l attacco al ribosoma e per iniziare la sintesi proteica La sequenza di coda o 3 UTR stabilizza il messaggero Entrambe interagiscono con le proteine del trasporto dei mrna e con proteine dei ribosomi

26 LA REGIONE DEL PROMOTORE Struttura di un promotore riconosciuto dalla RNA polimerasi II. Il box TATA serve a specificare il sito di inizio della trascrizione è riconusciuta da un fattore di inizio trascrizione Il box CAAT favorisce la trascrizione, se la seq è modificata si ha riduzione del livello della trascrizione I box GC servono a legare la RNApolimerasi II

27 GLI ENHANCER E I SILENCER a Eucarioti unicellulari TATA box, UAS sequenza attivatrice a monte, Silencer sequenza silenziatrice Sono tre elementi circa a 200pb a momte del sito inizio della trascrizione Gli enhancer e i silencer sono elementi distali del promotore, possono essere localizzati anche Kb a monte o a valle della TATA box b Eucarioti pluricellulari TATA box INR sequenza iniziatrice trascrizione RE elementi regolatori costituiscono il promotore prossimale

28 ATTIVATORI, COATTIVATORI E REPRESSORI Gli henancer esercitano la loro azione tramite gli attivatori e i coattivatori secondo il modello della figura I repressori si legano ai silencer interferendo con l azione degli attivatori TFIID, B, A, F, E e H sono i fattori BASALI della trascrizione

29 FINE

30 I GENI CHE CODIFICANO GLI RNA RIBOSOMALI I RIBOSOMI 4 6

31 I GENI CHE CODIFICANO GLI RNA RIBOSOMALI Fotografia al microscopio elettronico di geni ribosomali in trascrizione Interpretazione

32 ORGANIZZAZIONE DEI GENI RIBOSOMALI 25S, 18S e 5,8S 3 5 I geni ribosomali sono sequenze ripetute in tandem livello di ripetizione ca 10 3 copie/genoma Ogni unità di ripetizione comprende un gene per il 25S uno per il 5,8S e uno per il 18S separati tra loro dagli spaziatori interni (ITS) Ogni unità di ripetizione è separata dalle altre dallo spaziatore esterno (NTS+ETS) Il promotore della trascrizione dell rdna in X. laevis I terminatori della trascrizione dell rdna.

33 TRASCRIZIONE E MATURAZIONE DEGLI RNA RIBOSOMALI 25S, 18S e 5,8S 25 S

34 I GENI PER GLI RNA RIBOSOMALI 5S Organizzazione delle due unità di ripetizione del gene per l rrna 5S in frumento. A e B spaziatore nelle unità di 410 pb (sopra) e di 500 pb (sotto): la regione B è formata da sequenze perfettamente omologhe nelle due unità ribosomali. La trascrizione è svolta dalla RNApol III. La posizione +1 indica il punto di inizio della trascrizione Non hanno il promotore esterno ma due regioni ICR interne al gene

35 I GENI PER GLI RNA TRANSFER Struttura degli RNA transfer

36 LA TRASCRIZIONE E LA MATURAZIONE DEGLI RNA TRANSFER La trascrizione dei geni per gli RNA transfer viene svolta dalla RNA pol III Lo splicing dei trna avviene ad opera di una endonucleasi e di una ligasi di splicing

37 Splicing autocatalitico dell rrna di Tetrahymena termophila Nelle piante lo splicing autocatalitico avviene in alcuni precursori di trna e rrna mitocondriali e cloroplastici Gli RNA capaci di compiere splicing autocatalitico sono detti RIBOZIMI

38 FINE