ALLINEAMENTO DI SEQUENZE

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1 ALLINEAMENTO DI SEQUENZE Procedura per comparare due o piu sequenze, volta a stabilire un insieme di relazioni biunivoche tra coppie di residui delle sequenze considerate che massimizzino la similarita tra le sequenze stesse

2 L`allineamento dovrebbe portare all`appaiamento delle regioni simili condivisi dalle due sequenze. A volte possono essere adottati criteri differenti che portano a risultati diversi. Il problema risiede nel concetto di similarita`!! Non e` possibile allineare due sequenze senza definire dei criteri di similarita`. E` anche necessario disporre di un metodo che sulla base dei criteri di similarita` sia in grado di produrre un allineamento. Algoritmo: metodo di calcolo descrivibile con un numero finito di regole, che conduce ad un risultato dopo un numero finito di operazioni. L`efficienza in termini di tempo di esecuzione di un algoritmo e` determinata dal numero di operazioni necessarie ad eseguirlo. Il fattore tempo e` importante!!

3 La complessita` del problema di allineare sequenze di acidi nucleici e di proteine deriva dal fatto che deve essere considerata la possibilita` che il miglior allineamento comporti l`inserimento di gap nella sequenza Questa e` un`esigenza irrinunciabile in quanto nel corso dell`evoluzione si possono avere processi di inserzione e/o delezione che comportano una diversa lunghezza di sequenze omologhe. L`inserimento di gap comporta due principali complicazioni: uno relativo alla definizione di criteri di similarita` uno relativo alla possibilita` di avere algoritmi adeguati

4 Il primo punto e` facilmente risolvibile: si possono attribuire penalita` diverse per l`apertura di un gap ed il suo allungamento. Calcolo del punteggio di allineamento Date due sequenze costituite da una serie di residui (A1,A2... ) e (B1, B2...) il punteggio di un qualsiasi allineamento tra tutti i possibili puo` essere calcolato come: Lo score totale e` dell`allineamento e` dato come dagli score relativi alle singole coppie di residui appaiati S(a i,b i ) per tutti i valori di i compresi tra 1 e la lunghezza (L) dell`allineamento, a cui deve essere sottratta la somma delle penalita` dovute ai gap. Quindi y rappresenta la penalita` di apertura mentra g la penalita` di allungamento.

5 Molto piu` complesso e` invece lo studio di algoritmi per l`implementazione di questi criteri in modo efficiente In una sequenza lunga n caratteri e` infatti possibile inserire un gap in n-1 posizioni generando n sequenze diverse (compresa l`originale). Consentento gap piu` il numero di possibili sequenze aumenta in modo esponenziale!!

6 ALLINEAMENTO DI SEQUENZE A COPPIE AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC MULTIPLO KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKT- KFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs

7 Allineamento GLOBALE o LOCALE GLOBALE LOCALE considera la similarita tra due sequenze in tutta la loro lunghezza considera solo specifiche REGIONI simili tra alcune parti delle sequenze in analisi Global alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK... TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG Local alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK. TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHK

8 Nell`allineamento globale sono identificabili 14 identita` e tre sostituzioni conservative. Nel secondo caso si possono contare solo 13 identita` e una sostituzione conservativa. Quale allineamento e` da considerarsi il migliore? Da un punto si vista computazionale l`allineamento migliore e` quello che totalizza lo score massimo. Da un punto di vista biologico qual`e` l`allineamento migliore? Logicamente tutto dipende da cosa stiamo cercando!!

9 Programmazione dinamica Idea di base: la risoluzione di un problema deriva dalle risoluzione di sottoparti piu` piccole del problema. Inizializzazione a partire dai casi piu` piccoli. Memorizzazione delle soluzioni dei sottoproblemi ( non vengono ricalcolati) Prevede una relazione ricorsiva tra il problema corrente e le sue sottoparti piu` piccole

10 Inizio A fine Quante strade vanno da inizio ad A? Ci sono 6 strade... Di conseguenza per una questione di simmetria ci sono 6 strade anche da A verso fine. In tutto ci sono 36 percorsi. Assumendo che ci sia un costo per ogni percorso, dobbiamo controllarli tutti?

11 La risposta e` NO! La scelta del percorso migliore da A verso Fine e` indipendente dalla scelta del percorso da Inizio ad A. Se determiniamo il migliore dei 6 percorsi da Inizio ad A e determiniamo il migliore dei 6 percorsi da A a Fine il migliore percorso da Inizio a Fine e`: il miglior percorso da Inizio ad A seguito dal miglior percorso da A a Fine. Quindi non occorre considerare piu` di 12 percorsi attraverso A. Semplificazioni ancora maggiori sono possibili attraverso una suddivisione sistematica del problema. Il metodo di programmazione dinamica per trovare il percorso ottimale attraverso la matrice e` basato su questa idea.

12 Algoritmo di Needleman-Wunsch (allineamento globale) Algoritmo generale per il confronto tra sequenze. Trova il miglior allineamento globale di due sequenze. Calcola ricorsivamente l`allineamento ottimo per sottosequenze via via piu` lunghe (indipendenza e additivita`dei punteggi) Massimizza il punteggio di similarita` (numero massimo di match) Le sequenze vengono comparate attraverso una matrice 2D Ricostruzione dell`allineamento seguendo un percorso che comprende i punteggi piu` alti.

13 Tre step principali: 1) Assegnazione di un valore di similarita`. 2) Per ogni cella, cerca tutti i possibili percorsi che portano all`inizio della sequenza (permettendo inserzioni e delezioni) e attribuisce ad ogni cella il valore del percorso con punteggio massimo. 3) Ricostruzione dell`allineamento seguendo le celle con punteggio massimo per dare l`allineamento con il massimo punteggio.

14 La prima fase e` molto simile alla realizzazione di un dot matrix. All`interno di ogni casella si pongono i valori ottenuti da una matrice di sostituzione. La matrice di sostituzione usata non e` una matrice standard PAM o BLOSUM, ma una matrice normalizzata in modo da contenere solo score positivi, in modo da consentire il miglior allineamento globale.

15 Nella seconda fase del processo viene cercato il miglior allineamento considerando la possibilita` di inserimento di gap. L`obiettivo e` quello di cercare il percorso tra le caselle della matrice di allineamento che totalizzano il massimo punteggio in base alle regole stabilite. I salti tra una diagonale e la diagonale contigua corrispondono all`inserzione di un gap e dovranno essere penalizzati di conseguenza. Il modo in cui inserire un gap sono troppi: se una sequenza e` scritta da sinistra verso destra sul lato superiore della matrice e l`altra dall`alto verso il basso sul lato sinistro, allora qualsiasi percorso valido deve mantenere una direzione che va dall`angolo in alto a sinistra verso quello in basso a destra.

16 Nonostante una casella sia circondata da altre 8, un percorso valido potra` seguire solo 3 delle 8 caselle contigue. Le direzioni indicate dalle frecce colorate non sono consentite perche` corrispondono ad un ripiegamento dell`allineamento privo di senso. Inoltre quando il percorso prosegue orizzontalmente o verticalmente s dovra` considerare che puo` essere conteggiata solo una casella per riga e per colonna, che equivale a dire che un aminoacido non si puo` appaiare piu` di una volta. Il miglior percorso a monte resta comunque lo stesso, qualunque sia il valore a valle di una determinata casella. Calcolare il percorso piu` vantaggioso per arrivare a qualsiasi casella ed il punteggio totalizzato fino a quel punto (arriveremo a determinare la casella con punteggio massimo.)

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19 La terza ed ultima fase del processo consiste nel cercare la casella con punteggio massimo e nel procedere a ritroso per ricavare i singoli appaiamenti.

20 Concludendo: con questo metodo di programmazione dinamica e` possibile allineare due sequenze con un numero di operazioni dell`ordine di grandezza del prodotto delle lunghezze delle sequenze. Per ogni casella sono considerate tre possibili origini del percorso, una diagonale senza penalita` (match), e altre due (orizzontale e verticale) che corrispondono all`allineamento di un aminoacido di una sequenza con un gap nell`altra con (penalita`). Tutte le possibilita` di gap sono considerate in modo esaustivo tutti i punteggi tendono ad aumentare=> allineamento globale. Il punteggio massimo si trova in corrispondenza dell`ultima riga o nell`ultima colonna.

21 Algoritmo Smith-Waterman (allineamento locale) Trova la regione piu` lunga della prima sequenza che produce un allineamento ottimale, dati certi parametri, con una regione della seconda. SIMILARITY SCORE: punteggio per i match dei residui. Ad esempio 2 per il match, -1 mismatch GAP PENALTY: W=a+b(k-1) W= penalita` per un gap di lunghezza k a=gop (Gap Open Penalty) b=gep (Gap Extension Penalty)

22 Utilizzo di matrici di sostituzione contenenti valori anche negativi, come le matrici PAM e BLOSUM. Questo permette di ottenere allineamenti locali. Il concetto di locale comporta che, una volta definito il punto di inizio e di finedi un allineamento, il punteggio risultante non deve essere influenzato dalle regioni esterne dell`allineamento. Queste ultime infatti non possono contribuire perche` altrimenti sarebbero incluse nell`allineamento Tuttavia non devono neppure pesare negativamente! Ogni percorso a monte che totalizza un punteggio negativo viene ignorato poiche` e` piu` vantaggioso considerare al suo posto un inizio di allineamento => viene quindi considerata un`altra opzione, quando il valore e` negativo questo diventa 0

23 Il recupero del punteggio massimo si un allineamento locale, non si limita alla ricerca nell`ultima riga o colonna. Un allineamento locale puo` iniziare in qualsiasi punto della matrice. Solitamente si possono cercare tutti gli allineamenti locali che superano un certo cut-off.

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25 Differenze Needleman-Wunsch 1) Allineamento globale 2) Il punteggio di allineamento per una coppia di residui e` >=0 3) Non e` richiesta la gap penalty 4) I punteggi non possono diminuire tra due celle di un percorso Smith-Waterman 1) Allineamento locale 2) Il punteggio di allineamento per una coppia di residui puo` essere positivo o negativo 3) Richiede una gap penalty per funzionare in modo efficiente 4) I punteggi possono aumentare, rimanere uguali o diminuire tra celle di un percorso