Il locus AB0 presenta 4 alleli: A1, A2, B, 0 Ciò comporta l esistenza di 6 fenotipi e 10 genotipi.

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2 Il locus AB0 presenta 4 alleli: A1, A2, B, 0 Ciò comporta l esistenza di 6 fenotipi e 10 genotipi.

3 LE SPECIFICITÀ ABH SONO LEGATE ALLA COMPONENTE SACCARIDICA E AL TIPO DI LEGAMI CHE QUATTRO ZUCCHERI ASSUMONO SULLA PARTE TERMINALE DI UNA CATENA SACCARIDICA DEFINITA SOSTANZA DI BASE SULLA QUALE SI HA LA BIOSINTESI DEGLI ANTIGENI ABH, MA ANCHE DI ALTRI COME I LEWIS, P, I e i. GENE GLYCOSYL TRASFERASE IMMUNODOMINANT SUGAR H A L-Fucosyltransferase N- Acetylgalactoseamine N-Acetyl-galactosaminyltransferase L-Fucose B D- Galactosyltransferase D-Galactose

4 L assenza degli antigeni A e B nel fenotipo O derivano dalla delezione di una singola base nucleotidica nella porzione del DNA codificante le transferasi e responsabile dello spostamento della cornice di lettura con conseguente sintesi di una proteina sprovvista di attività transferasica. ALLELI A B O Base n 258 G G Delezione 523 C G C 700 G A G 793 C A C Legenda G=guanina C=citosina A=adenina Differenze nucleotidiche riscontrate fra gli alleli ABO

5 Gli antigeni eritrocitari o gruppi sanguigni polisaccaridici AB0 Lewis P H I proteici Rh

6 Rh protein family Proteine Famiglia delle proteine Rh Antigeni Localizzazione genica RhD RhCcEe RhAG Proteine accessorie LW IAP GPB Band 3 D Ce,CE,ce,cE LW Non conosciuta N, S, s, U Diego 1p36.13-p p36.13-p p21.1-p11 17,75,174 19p q q28-q31 17q12-q Avent N., Blood 2000

7 Rh protein family Il 40% di omologia indica una relazione ancestrale 12 domini transmembrana con le estremità N-terminale e C-terminale rivolti verso la porzione intracitoplasmatica I primi 41 aminoacidi all estremità N- terminale sono identici RhD differisce da RhCE solo per aa lungo l intera sequenza della proteina. Nonostante questa omologia le proteine RhCcEe non esprimono l antigene D e viceversa Avent N., Blood 2000

8 Soggetti Rh-negativi Nella popolazione Caucasica i soggetti RhD- hanno la delezione del gene RhD In altre popolazioni come i Giapponesi o gli Africani il fenotipo D- non è legato alla perdita del gene. Avent N., Blood 2000

9 Sistema LEWIS Gli Ag sono correlati con quelli AB0; i G.R.acquisiscono il fenotipo adsorbendoli dal plasma; il gene è distinto ma correlato con quello del carattere di secretore Sistema P La maggioranza degli uomini è P1 + ; le reazioni trasfusionali sono rare ma gravi Sistema MN Gli Ag sono glicoforine; gli Ac anti-m o N umani sono rari; se IgG eritroblastosi

10 Sistema KELL e Sistema Duffy Possono causare reazioni trasfusionali gravi, evitabili con la prova crociata maggiore Gli antigeni K e Fy(a) / (b) sono buoni immunogeni ed evocano la produzione di anticorpi di isotipo IgG

11 I principali obiettivi del trasfusionista sono due: il primo è prevenire la reazione trasfusionale identificando i pazienti immunizzati e fornendo loro sangue compatibile; il secondo è prevenire la produzione di anticorpi, scegliendo i donatori più simili, come caratteristiche gruppoematiche, al paziente.

12 COMPATIBILITY TESTING What is Compatibility Testing? Pre Transfusion Protocol to insure the Patients health and the survival of transfused red cells. It includes: Patient Identification, Labeling, Collection of patient sample, ABO, Rh, Crossmatch search for irregular antibodies.

13 PROVE DI COMPATIBILITA Prove crociate IL SIERO DEL PAZIENTE VIENE INCUBATO A 37C CON I GLOBULI ROSSI DELLE UNITA DI SANGUE DA TRASFONDERE CONSENTE DI RILEVARE: L INCOMPATIBILITA PER IL SISTEMA ABO ED EVENTUALI Ab DIRETTI CONTRO Ag a FREQUENZA MOLTO BASSA

14 Steps In Compatibility Testing Review available Recipient Records FOR: PREVIOUS ABO & Rh Any PRIOR UNEXPECTED Antibodies Any PRIOR ADVERSE REACTIONS to transfusion Correct identification of Donor Unit by Confirming 1. The unit ID with the ID on the donor unit s records 2. The unit s ABO & Rh on the record for consistency with that of the patient

15 Gli anticorpi verso gli antigeni eritrocitari anticorpi naturali anticorpi irregolari

16 Comprendono: l anti-a dei soggetti B, l anti B dei soggetti A e l anti-a, anti-b e anti-ab dei soggetti 0. Oltre questi ricordiamo, gli anticorpi irregolari anti-a1 che si ritrovano nei soggetti con fenotipo A2 e A2B e l anti-h che si può ritrovare in alcuni soggetti A1, A1B, B ed in tutti i soggetti con fenotipo Bombay. Anti-A1: i sieri dei soggetti B e 0 contengono una miscela di anti-a e anti-a1. L anti-a1 è anche presente nel 2% dei soggetti A2 e nel 25% nei soggetti A2B Anti-H: esistono 3 tipi di anti-h, uno attivo a 37 C che si osserva nei soggetti con fenotipo Bombay, uno freddo con optimum termico a 4 C (nei soggetti A1, A1B o B non secretori di sostanze gruppo specifiche) e uno che viene formato come autoanticorpo.

17 Anticorpi Irregolari Per ricerca di anticorpi irregolari, si intende quell insieme di procedure atte alla evidenziazione della presenza di anticorpi inattesi nel siero di un paziente. Ricerca di anticorpi: 1. Prove di compatibilità 2. Coombs diretto 3. Prova indiretta del gruppo sanguigno

18 Test di Coombs Test di emoagglutinazione in vitro utilizzato per evidenziare anticorpi eritrocitari Test diretto Test indiretto

19 ANTIGRAM L ANTIGRAM di un pannello eritrocitario ad 11 cellule costituito da aliquote di emazie del gruppo 0 provenienti da singolo donatore selezionate per la loro composizione antigenica ci mostra i più frequenti anticorpi che si possono trovare nel siero di un paziente.

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21 REAZIONI TRASFUSIONALI IMMUNOLOGICHE emolitiche febbrili non emolitiche Allergiche (cutanee e anafil.) edema polmonare non cardiogeno (TRALI) ACUTE NON IMMUNOLOGICHE contaminazione batterica sovraccarico circolatorio emolisi fisica/chimica danni da conservazione

22 EDEMA POLMONARE NON CARDIOGENO transfusion related acute lung injury (TRALI) Grave sindrome respiratoria, caratterizzata dal classico quadro radiologico e sintomatologico senza insufficienza cardiaca, che interviene durante o entro 6 ore dal termine della trasfusione con una frequenza variabile 1:5000-1: eventi trasfusionali (le forme lievi frequentemente non vengono diagnosticate) E causato da una reazione tra leucoagglutinine del donatore e leucociti del ricevente con formazione di aggregati leucocitari che, intrappolati nel microcircolo polmonare, ne alterano la permeabilità vasale

23 REAZIONI TRASFUSIONALI RITARDATE IMMUNOLOGICHE emolitiche ritardate alloimmunizzazione leucociti piastrine porpora post-trasfusionale da HPA1-a NON IMMUNOLOGICHE emosiderosi indotta dalle trasfusioni trasmissione malattie infettive (virali)

24 REAZIONI IMMUNOLOGICHE EMOLITICHE RITARDATE SINTOMI febbre, ittero, ANEMIA inattesa (7-10gg dopo l infusione) puo essere necessaria un altra trasfusione talvolta asintomatiche EZIOLOGIA anticorpi IgG risposta anamnestica Rh,Kell,Duffy, Kidd, MNS anticorpi siero - eluato

25 Complicanze infettive virali: epatite B, C HIV1-2 Mononucleosi infettiva CMV HTLV 1-2 Parvovirus batteriche endogene (dal sangue del donatore) treponema,brucella,rickettsia,yersinia,campylobacter,staph.aureus, strept.viridans esogene (dalla cutedel donatore o dall ambiente) staph.epidermidis,micrococcus,sarcina,pseudomonas,flavobacterium bacillus parassiti malaria,tripanosoma,toxoplasma,babesia,leishmania

26 La disponibilità di sangue è limitata da ciò deriva la necessità di stabilire i criteri per un uso congruo di tale risorsa

27 Pazienti di competenza chirurgica Abitualmente viene richiesta una quantità di sangue eccedente le reali necessità, con conseguente sequestro delle unità non utilizzate da parte dei reparti per almeno due o tre giorni e conseguente invecchiamento del sangue stesso e quindi a rischio di scadenza. La soluzione a questo problema è l assegnazione a disposizione e la prova rapida di compatibilità. Pazienti di competenza medica Ai pazienti di competenza medica è raccomandata la seguente strategia: 1. Tipizzazione eritrocitaria per il maggior numero di antigeni prima di iniziare le trasfusioni. 2. Prova di compatibilità per ogni unità assegnata. 3. Ricerca di anticorpi irregolari. 4. Controllo autologo. Donne in gravidanza Devono essere sottoposte alle seguenti indagini: 1. Tipizzazione eritrocitaria. 2. Ricerca di allo-anticorpi irregolari. 3. Nel caso di compatibilità A B 0 eventualmente cross-match con le emazie del marito. Donatori di sangue La ricerca di anticorpi irregolari si esegue per i seguenti motivi. Evidenziare la presenza di anticorpi. Nel caso in cui sangue di gruppo 0 venga impiegato per un ricevente di altro gruppo.

28 GLI EMOCOMPONENTI Gli emocomponenti sono i prodotti della separazione degli elementi costituitivi del sangue e vengono ottenuti sia da una donazione tradizionale di sangue intero sia da una donazione mediante aferesi con separatore cellulare. Gli emocomponenti si distinguono in due grandi categorie: USO TRASFUSIONALE USO TOPICO

29 Emocomponenti: Classificazione Per uso Trasfusionale Concentrati eritrocitari convenzionali o modificati Concentrati piastrinici convenzionali o modificati Plasma fresco congelato Emocomponenti Concentrati leucocitari Concentrati di c. staminali da sangue periferico Sangue placentare Per uso Topico Colla di fibrina Gel piastrinico

30 Emocomponenti: Uso più frequente Preparazione di C.E. ; P.F.C. ; C.P. (da Buffycoat) Partendo da una donazione di 450 ml di sangue intero in sacca quadrupla Prima centrifugazione (a.t.a.) Emocomponenti Alta velocità Caratteristiche Parte superiore della sacca Strato intermedio tra il plasma e i globuli rossi Plasma povero di piastrine Buffy - coat ml di plasma (contiene la maggior parte del plasma da congelare.) 50 ml Contenenti: 10% di globuli rossi 70% di leucociti 80% delle piastrine Parte inferiore della sacca Globuli Rossi ml di globuli rossi ml di S.A.G.M (contengono circa il 30% di leucociti)

31 Seconda Centrifugazione (a.t.a.) Bassa velocità Emocomponenti Caratteristiche Parte superiore della sacca Concentrato Piastrinico Da Buffy-coat 1) Da singolo B.C. 1) 50 ml contenenti: x 10 9 piastrine 2) Da pool di 4-6 B.C. 2) ml contenenti: x 10 9 piastrine Parte inferiore della sacca B.C. povero di piastrine Contiene circa il 10% di globuli rossi e il 70% di leucociti donati

32 CONCENTRATI ERITROCITARI E PIASTRINICI MODIFICATI Concentrati Eritrocitari Modificati C. Eritrocitari leucodepleti C. Eritrocitari lavati C. Eritrocitari irradiati C. Eritrocitari congelati C. Eritrocitari per uso pediatrico C. Eritrocitari universali C. Piastrinici leucodepleti Concentrati Piastrinici Modificati C. Piastrinici lavati C. Piastrinici irradiati C. Piastrinici congelati

33 Quando si trasfonde? Emazie Chemioterapia Trapianto Anemia Aplastica Mielodisplasie Insufficienza midollare Piastrine Chemioterapia Trapianto Anemia Aplastica Mielodisplasie Insufficienza midollare CID Trombocitopatie Plasma CID HUS-TTP sovradosaggio di: anticoagulanti orali agenti trombolitici

34 In caso di emorragia acuta.. La trasfusione di emazie dovrebbe in teoria essere effettuata tanto rapidamente quanto è necessario per correggere il deficit di trasporto di ossigeno nella emorragia acuta una unità di emazie aumenterà il livello di emoglobina di 1 g/dl in una persona di 70 chilogrammi (3-4 ml/kg di emazie concentrate).

35 TRASFUSIONE DI GLOBULI ROSSI NELL ANEMIA CRONICA L obiettivo della trasfusione di globuli rossi in questi pazienti è di ridurre gli effetti deleteri dell anemia portando il tasso di emoglobina o l ematocrito al di sopra del livello stabilito. Sintomi dell anemia insorgono di solito quando il tasso di emoglobina scende al di sotto di g/dl. I sintomi includono tachicardia, dispnea/tachipnea, sensazione di testa vuota, sincope, astenia od intolleranza allo sforzo muscolare, angina, cefalea, claudicatio ed affaticamento. I sintomi possono esordire precocemente (ad esempio con tasso di emoglobina di 7 g/dl) in pazienti con età avanzata e/o con ridotta funzionalità cardiorespiratoria. Pazienti con tasso di emoglobina superiore ad 8 g/dl raramente richiedono trasfusione di globuli rossi.

36 Indicazioni per la trasfusione di un Indicato per concentrato incrementare l apporto eritrocitario di ossigeno ai tessuti : Hb < 8g/dl o Ht < 24% Hb < 9 g/dl in pazienti in programma per intervento Hb < 10 g/dl in paziente sintomatico per anemia in cardiopatia e/o pneumopatia Neonati con Hb <13g/dl ed exsanguinotrasfusione. Non sono indicati: per espandere il volume ematico in caso di carenza marziale e/o vitaminica in condizioni cliniche stabili

37 Note di buona pratica clinica Per valutare l efficacia della trasfusione occorre valutare le modificazioni dei parametri ematologici e riportarli nella cartella clinica La quantità di CE da trasfondere può essere calcolata con la seguente formula : Corrected Count Increment Q. tà sangue da trasfondere = 251 x peso Pz. in Kg x l incremento di Hb desiderato/ht medio unità da trasfondere

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39 Emazie congelate Congelate entro 7 giorni dal prelievo Metodica ad alto glicerolo conservate da 60 C a -80 C Metodica a basso glicerolo conservate in vapori di azoto liquido a temperatura compresa tra -140 C e -150 C Possono essere conservate per 10 anni Scongelate, lavate e ricostituite, sospese in una soluzione fisiologica. Conservate tra +2 e +6 C per non più di 24 ore CQ: Ht compreso tra 0,65 e 0,75% Hb >36g/unità Leucociti < 1x10 9

40 Concentrati piastrinici Indicati: Per il trattamento e profilassi delle emorragie dovute a carenza qualitativa o quantitativa delle piastrine Per i pazienti medici stabili e senza complicazioni il valore soglia è / µl Terapia dell emorragia nei pazienti medici con piastrine /µL Per i pazienti chirurgici il valore soglia è / µl Se il conteggio è compreso tra e / µl la trasfusione di piastrine è indicata solo in condizioni particolari (procedure a cielo coperto, neurochirurgia, campi operatori altamente vascolarizzati). CQ: Contenuto in piastrine = x 10 9 Plasma = ml. Leucociti < 1x10 9 Eritrociti<1x10 9 Ph tra 6,4-7,4 Consevate tra C in continua agitazione per 5gg

41 Non indicati: Nelle piastrinopenie da eccessiva distruzione (porpora trombocitopenica idiopatica, porpora trombotica trombocitopenica, sindrome uremica- emolitica, coagulazione intravascolare disseminata) nella circolazione extracorporea e nella trasfusione massiva a scopo profilattico come profilassi se il conteggio è >10.000/microlitro e il paziente è in condizioni stabili

42 Trasfusione di Piastrine

43 Valutazione clinica della risposta alla trasfusione piastrinica Viene effettuata tramite la formula del corretto incremento (Correct Count Increment) CCI = incremento della conta piastrinica (migliaia/µl) x superficie corporea in mq /numero di piastrine trasfuse (x ) La trasfusione viene considerata: efficace CCI >7500 parzialmente efficace CCI inefficace CCI <5000

44 Plasma per uso clinico Prodotto da sangue intero o da aferesi di donatori periodici e volontari Congelato entro 6 ore dalla donazione Congelato in maniera uniforme, entro 1 ora Conservato per 24 mesi se stoccato a - 40 C Scongelato in bagno con continua agitazione a temperatura tra + 30 e + 37 C Utilizzato nel più breve tempo possibile, non oltre 24 ore se conservato tra 2-6 C CQ: Deve contenere almeno il 70% del contenuto originale di Fattore VIII Proteine totali > 50 g/l Assenza di anticorpi irregolari clinicamente significativi Emazie residuo < 6 x10 9 Leucociti residuo <0,1x10 9 Piastrine residuo < 50x10 9 Assenza di precipitati visibili Sterilità

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46 Pretransfusion INR Predicts the 0.9 Effect of FFP Change in INR/unit FFP (0.0) (0.0) (0.0) (0.1) (0.1) (0.4) >1.6 Pre-transfusion INR

47 Crioprecipitato Costituito dalla frazione crioglobulinica del plasma fresco Scongelato lentamente a 2-6 C per 12 ore e concentrato ( per centrifugazione o sifonamento) in un volume finale di ml Contiene fatt.viii,fatt. di Von Willebrand, fibrinogeno, fatt.xiii e fibronectina CQ : Fatt.VIII 70% del contenuto di partenza

48 Indicazioni alla raccolta di sangue autologo. Tipo intervento Interventi di chirurgia vascolare maggiore Interventi a cuore aperto Protesi totale d anca Protesi totale di ginocchio Interventi correttivi per scoliosi Prostatectomia radicale Placenta previa Gravidanza plurima Trapianto di fegato Predeposito Si Si Si Si Si Si Si Si Si Recupero Si Si Si No Si Si No No Si

49 Emocomponenti per uso non trasfusionale Gel di piastrine azione di stimolo sulla rigenerazione tessutale derivato dall associazione del concentrato piastrinico ( fonte di fattori di crescita) con il crioprecipitato ( fonte di fibrinogeno, fibronectina e altri fattori procoagulanti) Colla di fibrina azione adesiva ed emostatica derivato da plasma (ricco fibrinogeno, fibronectina ed altre proteine plasmatiche con scarsa presenza di piastrine) Per essere utilizzati clinicamente devono essere attivati, utilizzando cloruro di calcio ( o gluconato di calcio) e trombina autologa o batroxobina Piastrine e plasma rappresentano una fonte autologa o omologa di fattori di crescita e proteine procoagulanti, clinicamente impiegabili (PRP)

50 L AFERESI SEPARATORE A FLUSSO DISCONTINUO SEPARATORE A FLUSSO CONTINUO

51 L AFERESI Densità g/cm 3 Diametro Volume µm 3 Plasma Piastrine Monociti Linfociti Neutrofili Eritrociti

52 L AFERESI AFERESI PRODUTTIVA SINGLE COMPONENT MULTI COMPONENT PLT PFC GR - PLT PFC - PLT DOPPIA PLT GR - PFC DOPPIA GR

53 CELLULE STAMINALI DA SANGUE PERIFERICO Vengono raccolti da donatore mediante leucoaferesi dopo mobilizzazione nel torrente circolatorio con fattori di crescita GM-CSF. Per ottenere un numero adeguato di cellule CD 34 è necessario procedere afereticamente da 3 a 4 volte il volume ematico (200 ml/kg di peso). Le cellule staminali da sangue periferico P.B.S.C. (Peripheral Blood Stem Cell) vengono sospesi in una soluzione contenente un crioprotettore (DMSO) e proteine (plasma-albumina) congelati e conservati a -180 C C in fase gassosa di azoto. Devono essere trasfuse subito dopo scongelamento a 37 C.

54 SANGUE PLACENTARE Contiene i progenitori emopoietici indispensabili ai fini del trapianto di midollo osseo sia autologo che allogenico ed è in grado di determinare un completo ripopolamento cellulare. Prelevato subito dopo la resezione del cordone ombelicale viene congelato nel più breve tempo possibile (in DMSO 10%). Viene conservato in azoto liquido a -140 C fino a 15 anni. Volume sacca : 60 ml; cellularità totali: >800*10 6 ; determinazioni in citofluorimetria delle cellule CD34 Tipizzazione HLA. Tale volume però non consente nell adulto di somministrare la dose minima cellulare raccomandato (20 milioni di cellule nucleate/kg di peso c o r p o r e o). Per ovviare a questi inconvenienti sono possibili programmi di espansione cellulare con aumenti in due settimane di circa 100 volte il numero di cellule staminali.