METODI FISICI DI FISSAZIONE

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1 METODI FISICI DI FISSAZIONE I metodi fisici di fissazione sono rappresentati da: Calore/essiccamento Raffreddamento/congelamento Il calore e l essiccamento sono impiegati solo in strisci di sangue ed in apposizioni di midollo osseo di regola sono seguiti da un ulteriore trattamento con metodi chimici (postfissazione).

2 RAFFREDDAMENTO/CONGELAMENTO Il freddo non è un agente fissativo in senso stretto, non garantisce una stabile conservazione delle strutture biologiche quando i tessuti vengono riportati a temperatura ambiente possono aver luogo tutte le modificazioni degenerative che intervengono dopo la morte del tessuto

3 RAFFREDDAMENTO/CONGELAMENTO Il freddo è un agente conservante piuttosto che un vero e proprio fissativo molto usato in istochimica, perché permette: Conservazione del tessuto, Indurimento del tessuto per la sezione Dopo aver ottenuto le sezioni si eseguono le reazioni istochimiche previste solo successivamente si fissa il tessuto con metodi chimici. (post-fissazione) In questo caso le reazioni istochimiche devono essere di durata relativamente breve (in genere, non più di mezz ora per scongiurare artefatti da dislocazione o da solubilizzazione di sostanze

4 RAFFREDDAMENTO/CONGELAMENTO Il congelamento del materiale oggetto di studio deve essere quanto più rapido possibile. si evita così la formazione di grossi cristalli di ghiaccio, capaci di alterare profondamente la struttura dei tessuti. I cristalli si formano allorché coesistono la fase liquida e quella solida per motivi termodinamici, è favorita la dissoluzione dei cristalli piccoli a favore dell accrescimento di quelli più grandi Un congelamento rapido impedisce la formazione di cristalli dall acqua e la stabilizza in uno stato solido amorfo, come il vetro (ghiaccio vetroso)

5 Metodi di congelamento Per ottenere un congelamento rapido si devono trattare pezzi molto piccoli (non più spessi di 1 3 mm), a basse temperature; negli studi più delicati, il congelamento può essere ottenuto mediante azoto liquido, a 170 C, isopentano, propano derivati alogenati del metano e dell etano (cosiddetti freon), In studi meno raffinati un congelamento sufficientemente rapido si può realizzare: introducendo i campioni da esaminare in una camera refrigerata, quale quella di un criostato, spruzzandovi sopra un gas che, espandendosi, sottrae calore (freon oppure anidride carbonica).

6 criostato I criostati sono apparecchi usati per sezionare tessuti congelati, costituiti da una camera refrigerata contenente un microtomo, cioè uno strumento per ottenere sezioni istologiche, anch esso refrigerato.

7 Sezioni criostatiche La sezione ottenuta con apparecchiature come il criostato viene montata su di un vetrino portaoggetto e lasciata essiccare Si può procedere ad una rapida fissazione con soluzioni alcoliche o formalina

8 Scopo delle sezioni criostatiche 1) Preservazione di strutture molecolari labili (esempio: molecole della matrice extracellulare, recettori di membrana, enzimi ecc.) degradabili a seguito dell impiego di fissativi chimici per tempi lunghi e della tecnica della inclusione 2) Rapidità di esecuzione (utile nella diagnotica intraoperatoria = estemporanea)

9 Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) Principi teorici del metodo Tecnica complessa che richiede l impiego di apparecchiature costose proposta da Altmann fin dal 1890, fu ripresa negli anni trenta del secolo passato da Bensley, Gersch, Hoerr e ulteriormente sviluppata in tempi più recenti ha il vantaggio di non richiedere l uso di liquidi fissativi trova impiego per ricerche citologiche, istochimiche e, con accorgimenti particolari, in microscopia elettronica. Il metodo esige: a) rapido prelievo del tessuto, b) raffreddamento alla temperatura dell azoto liquido, c) disidratazione a una temperatura compresa fra -60 e - 30 C d) inclusione in paraffina o carbowax e successivo taglio.

10 Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) ll raffreddamento (vedi quanto detto in precedenza) rappresenta il passaggio più delicato del metodo, da esso dipende la buona conservazione dei tessuti. Durante il raffreddamento è necessario evitare la formazione di grossolani cristalli di ghiaccio, che provocano profonde alterazioni nelle cellule e lasciano tracce ben visibili all analisi microscopica. Perciò il pezzo deve essere raffreddato il più velocemente possibile; ( formazione di ghiaccio vetroso, non cristallino), Nella pratica si impiegano pezzi piccoli (1 mm) e un liquido raffreddante con conduttività alta anche alle basse temperature, quale azoto liquido, isopentano (metilbutano).

11 Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) La disidratazione si effettua in base al seguente principio: In un pezzo di tessuto congelato esposto a una pressione di vapore inferiore a quella della pressione di equilibrio del ghiaccio, quest ultimo sublima con il conseguente essiccamento del tessuto il pezzo viene posto in un recipiente adeguatamente raffreddato nel recipiente viene ottenuto un vuoto spinto atmosfere mediante una pompa a vuoto Il vapore d acqua viene allontanato dalla stessa pompa a vuoto

12 Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) inclusione Una volta completata la disidratazione il pezzo viene incluso in paraffina o in carbowax: i pezzi sono lasciati cadere in un piccolo recipiente contenente paraffina che viene portata al punto di fusione negli apparecchi più perfezionati, l inclusione avviene nello stesso recipiente nel quale è stata effettuata la disidratazione