La sintesi delle proteine

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1 La sintesi delle proteine

2 Struttura del trna

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4 In che modo l informazione contenuta sotto forma di sequenze nucleotidiche nel DNA e nell RNA si traduce nella sequenza amminoacidica delle proteine? Esperimenti preliminari con RNA sintetici a sequenza monotona hanno aperto la strada alla decifrazione del codice. mrna sintetici a sequenza monotona Sintesi proteica in vitro utilizzando estratti batterici ed amminoacidi radiomarcati UUUUUUUUUUUU AAAAAAAAAAAA CCCCCCCCCCCC In ciascuna preovetta viene messo un amminoacido radioattivo differente polipeptide costituito da 4 GGGGGGGGGGG 3 1 fenilalanina radioattiva polipeptide costituito da prolina radioattiva 2 polipeptide costituito da lisina radioattiva 4 polipeptide costituito da Glicina radioattiva

5 Il processo di sintesi delle proteine: 1) Attivazione degli amminoacidi e formazione degli amminoacil-trna ATP ATP PP Amminoacido Amminoacil-AMP X Y Z Amminoacil-tRNA sintetasi CCA-3 OH trna anticodone AMP X Y Z CCA Amminoacil-tRNA X Y Z Amminoacil-AMP CCA-3 OH trna Amminoacil-tRNA sintetasi

6 H O H O R C C O - + ATP R C C AMP NH 3 + PP NH 3 + Attivazione dell amminoacido 3 OH A C C NH 3 + R C C H 3 O A C C O trna AMP Formazione dell amminoacil amminoacil-trna

7 L inizio della sintesi proteica richiede l interazione l della subunità minore con un amminoacil-trna carico e con l mrnal (anche, in vitro, sotto forma di una singola tripletta ribonucleotidica) subunità 30S codone tripletta ribonucleotidica anticodone C C A 3 O AA amminoacil-trna C C A 3 O - AA

8 Utilizzando tutte le triplette ribonucleotidiche e tutti i trna esistenti legati ad amminoacidi radioattivi, è stato decifrato il codice genetico, stabilendo la corrispondenza tra amminoacidi e triplette te Se c èc corrispondenza tra codone e anticodone,, viene incorporato nel complesso d inizio d un amminoacido radioattivo, identificabile mediante autoradiografia C C A 3 O - AA C C A 3 O - AA Se non c èc corrispondenza tra codone e anticodone,, il complesso d inizio d risulterà essere non radioattivo.

9 Nirenberg e Ochoa hanno studiato la formazione di complessi d inizio combinando tutte le 64 diverse triplette ribonucleotidiche con i 20 diversi amminoacil-trna. Ciascuna miscela di reazione è stata poi fatta passare attraverso un filtro che trattiene i complessi d inizio. Se un amminoacil-trna radioattivo entra a far parte del complesso, in quel punto il filtro sarà radioattivo e quindi darà un segnale in autoradiografia. 64 diverse triplette ribonucleotidiche Amminoacil-tRNA carichi con i 20 amminoacidi radioattivi

10 Esito dell autoradiografia 64 diverse triplette ribonucleotidiche Amminoacil-tRNA carichi con i 20 amminoacidi radioattivi Il segnale in nero indica la presenza di radioattività sul filtro, quindi una corrispondenza tra codone e anticodone. Si noti che tre triplette ribonucleotidiche non permettono la formazione di complessi d inizio con nessuno degli amminoacil-trna disponibili, segno che a queste triplette non corrisponde alcun amminoacido e che vengono utilizzate come segnali di punteggiatura (termine della traduzione). Alcuni amminoacil trna carichi con lo stesso amminoacido riconoscono triplette diverse, ma una tripletta specifica sempre lo stesso amminoacido

11 Tabella di corrispondenza codoni - amminoacidi UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Phe Phe Leu Leu Leu Leu Ile Ile Met Met Val Val UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG UAU UAC UAA UAG CAU CAU CAC CAC CAA CAA CAG CAG AAU AAU AAC AAC AAA AAA AAG AAG GAU GAU GAC GAC GAA GAA GAG GAG UGU UGU UGC UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Ser Ser Pro Pro Thr Thr Ala Ala Tyr Tyr Stop Stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Cys Cys Stop Stop Trp Trp Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly

12 4 3 Triplette=Codoni Senza virgole Non embricato Degenerato o Ridondante Universale Proprietà del codice genetico

13 Il codice genetico è a triplette e senza virgole HAI SEI API BLU PER TRE MIE ZIE PIE? 1a delezione: S HAI EIA PIB LUP ERT REM IEZ IEP IE? 2a delezione: A HAI EIP IBL UPE RTR EMI EZI EPI E? 3a delezione: I HAI EIP BLU PER TRE MIE ZIE PIE? leggibile illeggibile illeggibile leggibile in parte

14 Il codice genetico è a triplette e senza virgole Codice 6 CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Inserzione cornice di lettura corretta CATGCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Inserzione Delezione cornice di lettura errata CATGCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa3 Aa3 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 cornice di lettura corretta Due mutazioni frameshift si compensano? Allora il codice deve essere Ņsenza virgole Ó Due mutazioni frameshift di segno opposto si compensano

15 Doppi Mutanti Codice 12 CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Inserzione Delezione cornice di lettura corretta CATGCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa3 Aa3 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Inserzione Inserzione cornice di lettura corretta CATGCATCATGCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa3 Aa4 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Delezione Delezione cornice di lettura errata CATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCA Aa1 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 cornice di lettura errata Due mutazioni frameshift dello stesso segno non si compensano

16 Tripli Mutanti Codice 14 CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Inserzione CATGCATCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Aa3 Inserzione CATGCATGCATCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa4 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Aa5 Inserzione cornice di lettura corretta cornice di lettura errata cornice di lettura errata CATGCATGCATGCATCATCATCATCATCATCAT Aa1 Aa2 Aa4 Aa6 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 Aa1 cornice di lettura corretta Tre mutazioni frameshift dello stesso segno si compensano Inoltre, il codice deve essere anche altamente degenerato. Se esistessero solo 20 codoni di senso, nel tratto di DNA modificato si genererebbero frequentemente codoni non-senso incompatibili con la funzione di tipo selvatico della proteina

17 Il codice genetico non è embricato Una mutazione puntiforme per sostituzione cambia un solo aa nella catena polipeptidica Il codice genetico è universale Tutte le cellule procariotiche e eucariotiche usano lo stesso codice genetico* Usando sistemi di sintesi proteica in vitro, estratti di E.coli possono tradurre mrna di qualsiasi specie *alcune differenze nel DNA mitocondriale

18 Il codice è universale, ma con qualche eccezione

19 Mutazioni puntiformi Frameshift: inserzione o delezione che cambia la cornice di lettura del codice Mis-senso: cambio di significato di un codon Non-senso: conversione di un codon significativo in un codon di stop Sinonime: il significato del codon non cambia

20 Quanti diversi trna esistono in una cellula? L oscillamento (wobble) sulla prima posizione dell anticodone consente di ridurre il numero dei trna necessari

21 Quanti diversi trna esistono in una cellula? A causa dell oscillamento (wobble) sulla prima posizione dell anticodone, lo stesso trna può riconoscere codoni sinonimi L oscillamento consente di ridurre il numero di trna necessari da 61 a meno di 35

22 IF1 IF2 GTP IF3 Subunità minore 5 AUG CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG 3 I fattori d inizio interagiscono con la subunità minore del ribosoma

23 IF1 IF2 GTP IF3 5 3 AUG CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG 3 -UAC-5 Met Il complesso Subunità minore-if1 e IF2-GTP si associa con l mrna ed il trna iniziatore, mentre IF3 viene rilasciato.

24 IF1 IF2 GDP IF3 5 3 AUG UAC CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG GGA Met Gly La subunità maggiore si associa al complesso e recluta il trna carico corrispondente al secondo codone sull mrna. I fattori IF1 ed IF2 vengono rilasciati, con idrolisi del GTP in GDP + Pi. Sito P Sito A

25 5 3 AUG UAC CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG GGA Gly Si forma il legame peptidico tra il gruppo carbossilico della Met ed il gruppo amminico della Gly Met

26 5 3 AUG CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG GGA UAA Gly Ile UAC Met Scorrimento che rende di nuovo disponibile il sito A ad accettare un trna corrispondente al terzo codone dell mrna. Distacco del trna scarico.

27 L allungamento della catena proteica è mediato da fattori detti di allungamento (Elongation Factors) con idrolisi di GTP.

28 UAA UAA GTP UAA Al sito A Ile Ile Ile Pi GTP EF-Tu GDP EF-Tu GDP GTP EF-Ts EF-Tu EF-Ts EF-Ts

29 5 AUG CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG UGA 3 Nessun trna corrispondente al codone UAG. Nel sito A entra un fattore di rilascio (RF) Thr Ser Met Gly Ile Val Arg Lys Trp Cys RF

30 UGA 5 3 AUG CCU AUU GUA CGC AAA UGG UGU UCU ACU UAG Il fattore di rilascio induce il disassemblaggio del ribosoma ed il distacco della catena polipeptidica RF Met Gly Ile Val Arg Lys Trp Cys Ser Thr

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35 INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA Inibitore Nei procarioti tetraciclina Meccanismo di azione blocca il legame dell aa t-rna al sito A del ribosoma streptomicina cloranfenicolo eritromicina rifamicina Nei procarioti e negli eucarioti puromicina Solo negli Eucarioti cicloesimide α-amanitina blocca le modificazioni strutturali del ribosoma alterando la fedeltà della traduzione blocca la reazione della peptidiltransferasi associata al ribosoma blocca la traslocazione si lega alla RNA pol e blocca la sintesi del RNA causa il rilascio prematuro della proteina nascente (mima un aa t-rna) blocca la reazione della peptidiltransferasi associata al ribosoma blocca la sintesi del mrna legandosi alla RNA pol II

36 Costo energetico della aggiunta di un aa a una catena polipeptidica 1 ATP (a AMP) per attivazione dell aa 1 GTP (a GDP) per allungamento 1 GTP (a GDP) per traslocazione Totale = -29 kcal/mole (legame peptidico = +5 kcal/mole) + 1 ATP per posizionamento di AUG nel sito P + 1 GTP per terminazione Velocità della sintesi proteica Procarioti Eucarioti 15 aa/sec 2 aa/sec

37 Il trna di inizio (trna Met) è l unico trna che deve (e può) entrare nel sito P