Strategie di purificazione di proteine

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1 Laurea Magistrale in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti Strategie di purificazione di proteine Lezione n.xx-2-23

2 PRINCIPIO - ALIMENTI DA MATRICI SOLIDE E LIQUIDE MATRICI SOLIDE - ROMPERE LA STRUTTURA CELLULARE; - REINTRODURRE UN NUOVO ORDINE SULLA BASE DELLE SEGUENTI PROPRIETÀ PRINCIPALI: 1) Solubilità (in soluzioni saline; in solventi organici; al variare del ph della soluzione; al variare della temperatura, ecc.); 2) Adsorbimento e ripartizione tra fasi; 3) Proprietà acido-basiche (cromatografia a scambio ionico; elettroforesi; focalizzazione isoelettrica; ); 4) Grandezza molecolare (setaccio molecolare/gel-filtrazione; ultracentrifugazione;..); 5) Proprietà idrofobiche (cromatografia ad interazione idrofobica; cromatografia a fase inversa); 6) Proprietà biologiche (cromatografia di affinità)

3 Le domande da porsi Quantità? Preparativa o analitica? Grado di purezza? Forma? Nativa o denaturata? Fattori che influenzano la scelta Costo Tempo

4 Strategia di purificazione di proteine Indispensabile: Procedere velocemente, a freddo (se possibile!) ed inattivare le proteasi Sviluppo di un metodo di saggio adeguato; Selezione del materiale di partenza migliore; Estrazione (solubilizzazione) della proteina; Sviluppo della serie di passaggi di frazionamento, concentrazione e conservazione. Quantizzazione della proteina e calcolo della resa durante la purificazione.

5 Sviluppo di un metodo di saggio adeguato Caratteristiche 1. Deve essere eseguibile rapidamente su molti campioni; 2. Deve indicare in modo affidabile la quantità della proteina desiderata presente ai vari stadi di purificazione (specificità, sensibilità, riproducibilità); 3. Non deve far diminuire in modo significativo la resa totale. Metodi Proteine direttamente misurabili. - Valutazione dell attività (enzimi). - Rilevazione della presenza di colore (presenza di gruppi che assorbono ad una certa lunghezza d onda o assorbimento specifico ad una certa lunghezza d onda. - Visualizzazione della banda corrispondente su gel (proteine presenti in grande quantità). Proteine non direttamente misurabili. - Rivelazione mediante utilizzo di anticorpi. - Marcatura radioattiva o fluorescente.

6 Valutazione dell attività (enzimi). Saggio per la glucosio-6-p-deidrogenasi La reazione: glucosio-6p-deidrogenasi Glucosio -6-P + NADP + 6-P- gluconato + NADPH +H + La presenza dell enzima è indicata dall aumento dell assorbimento a 340 nm che è dovuto solo al NADPH. Applicando la legge di Lambert e Beer A= xlxc (dove l è in genere = 1) si calcola la concentrazione molare di NADPH c = A

7 Esempi di saggio di proteine non direttamente misurabili Visualizzazione diretta su gel Immunorivelazione

8 Selezione del materiale di partenza migliore Se sono disponibili materiali di partenza diversi, scegliere la migliore combinazione dei seguenti parametri: Maggiore quantità di proteina Costi meno elevati Estrazione più agevole

9 Estrazione (solubilizzazione) della proteina Per estrarre una proteina occorre solubilizzarla per i successivi passaggi di purificazione. proteine proteine proteine extracellulari intracellulari di membrana separazione disintegrazione disintegrazione dalle cellule cellulare cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto) isolamento della frazione cellulare isolamento della frazione di membrana, solubilizzazione tecniche cromatografiche (logica nella sequenza)

10 Separazione dalle cellule

11 Disintegrazione cellulare

12 Potter Pistone Camera di compressione Ultraturrax Valvola a spillo French Press

13 Waring Blendor Sonicatore

14 Chiarificazione dell estratto (1) Allontanamento del particolato: filtrazione (garza o carta) centrifugazioni; Allontanamento degli acidi nucleici: protammina solfato o streptomicina al 2% (p/v); Allontanamento delle proteine con caratteristiche differenti: salting in, salting-out; precipitazione isoelettrica; precipitazione con acetone o alcool; denaturazione al calore.

15 Protein denaturation Protein solubility Chiarificazione dell estratto (2) La proteina desiderata ha caratteristiche differenti dalla maggior parte delle proteine presenti nell estratto! E molto acida o molto basica? PRECIPITAZIONE ISOELETTRICA Precipita ad una particolare concentrazione di sali? SALTING-IN, SALTING-OUT Precipita selettivamente in presenza di solventi organici? PRECIPITAZIONE CON ACETONE O ALCOOL. Resiste a temperature elevate? DENATURAZIONE AL CALORE. C

16 Isolamento della frazione cellulare Centrifugazione frazionata

17 Solubilizzazione delle proteine di membrana

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