La tubercolosi è un infezione batterica causata da Mycobacterium tubercolosis

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1 La tubercolosi è un infezione batterica causata da Mycobacterium tubercolosis e caratterizzata da un accentuata iper-sensibilità cellulo-mediata e dalla formazione di granulomi nei tessuti infetti. La sede classica della malattia è il polmone, ma possono essere colpiti anche altri organi; in assenza di un trattamento efficace nelle fasi attive della malattia si assiste ad una cronica progressione della malattia con esito infausto [Isselbacher et al. 1995]. Prima del 1950, le persone erano ben consapevoli di cosa significasse la tubercolosi, poichè questa malattia rappresentava la causa primaria di sofferenza e morte nelle persone di qualsiasi età. Durante gli anni 50 e 60, in tutti i paesi sviluppati è stata condotta un efficace campagna volta all eradicazione della tubercolosi, tramite l utilizzo del test della tubercolina, esami radiografici ed alla somministrazione di antibiotici anti-tubercolari [Perry et al. 2004]. Questo non si è, però, verificato in molte nazioni povere. In alcuni paesi si stima che i nuovi casi siano almeno 400 per abitanti all anno e, come si osserva in America Settentrionale ed in Europa, miseria e tubercolosi vanno di pari passo. Inoltre, l abbondante e poco controllato utilizzo di antibiotici antitubercolari, ha fatto sì che emergessero ceppi resistenti ai farmaci, (resistenze singole e crociate), che risultano così essere molto difficili da trattare dal punto di vista farmacologico e responsabili delle patologie note come Mdr ed Xdr-Tb (Multi-drug resistant e Extensively-drug resistant tubercolosis) [Matteelli et al. 2007]. Nel 1991 negli Stati Uniti sono stati segnalati casi di tubercolosi, e l incidenza è andata aumentando dal 1985 in poi (incremento del 15,8% in cinque anni). Nel Nord America come in Europa, la tubercolosi tende ad essere

2 una malattia degli anziani (spesso diffusa in ricoveri e case di riposo), dei più poveri, delle minoranze etniche e dei pazienti con AIDS. [Isselbacher et al. 1995]. La ricomparsa della malattia nei paesi sviluppati è principalmente dovuta al turismo,ad esuli e persone in cerca di lavoro provenienti dai paesi poveri, ignari di avere la malattia [Perry et al. 2004]. Nelle aree ad elevata prevalenza, la tubercolosi colpisce in modo analogo sia le zone rurali, che quelle urbane. Nei paesi dove l infezione da HIV è endemica, la tubercolosi solitamente è la più importante causa singola di morbosità e mortalità dei pazienti con AIDS. In base ad una stima ragionevole dell ampiezza del problema, si può affermare che circa un terzo della popolazione mondiale è entrato in contatto con M. tubercolosis, che vi sono 30 milioni di casi di malattia attiva, che ogni anno si verificano 10 milioni di nuovi casi e che 3 milioni di persone muoiono ogni anno nel mondo a causa della tubercolosi. Questa malattia è verosimilmente causa del 6% di tutti i decessi che si verificano nel mondo. [Isselbacher et al. 1995]. Si calcolano 8,8 milioni di nuovi casi all anno, concentrati per il 60% in Asia ed il 28% in Africa. I soggetti extracomunitari risultano anche essere portatori di micobatteri non tubercolari, detti atipici o MOTT (Mycobacteria Other Than Tubercular), solitamente opportunisti, che però in soggetti debilitati o con sistema immunitario depresso, sono in grado di dare patologie, più frequentemente a carico del sistema respiratorio. 8

3 Questa situazione ha, quindi, reso nuovamente necessari meticolosi metodi diagnostici per la ricerca dei micobatteri. In questo lavoro sono stati analizzati mediante tecniche microscopiche, colturali e molecolari, i campioni biologici di pazienti interni ed esterni pervenuti in otto mesi (da novembre 2006 a giugno 2007) presso la sezione di Microbiologia dell U.O. di Patologia Clinica dell Azienda Ospedaliera Bolognini di Seriate (Bg). L indagine è stata condotta su diversi materiali biologici, quali: espettorato, bronco-lavaggio, bronco-aspirato, liquido pleurico, urine, liquido ascitico, liquido pericardico, liquor, pus, materiale da ago- aspirato e biopsie. La diagnostica di laboratorio ha previsto: a) la ricerca dei micobatteri tramite esame microscopico, effettuato sul campione diretto dopo colorazione di Ziehl-Neelsen, che mette in evidenza l eventuale presenza di bacilli acido-alcool resistenti (BAAR); b) esame colturale, con coltura dei campioni su terreno liquido MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes) e terreno solido IUTM (Lowenstein- Jensen Medium Base without Starch Medium), previa decontaminazione dei campioni, atta ad eliminare eventuali batteri contaminanti dalle colture. L eventuale crescita batterica deve poi essere validata da esame microscopico delle colonie, sempre con colorazione di Ziehl-Neelsen, per confermare la presenza di micobatteri; c) PCR (Polimerase Chain Reaction) per Mycobacterium Tubercolosis Complex (MTC), su campione diretto. Ad esame colturale positivo, si è provveduto ad inviare le colonie di crescita presso il reparto di Microbiologia e Virologia degli Ospedali Riuniti di 9

4 Bergamo, centro di riferimento per l identificazione dei micobatteri, in quanto laboratorio di terzo livello. Presso questa struttura di riferimento, sui materiali inviati positivi per bacilli acido-alcol resistenti (BAAR) vengono eseguiti i seguenti esami: a) una PCR per Mycobacterium Tubercolosis Complex (MTC), che se positiva dà la definitiva conferma per la presenza di MTC nel campione; b) un test di sensibilità ai farmaci anti-tubercolari di prima linea, al fine di individuare eventuali ceppi resistenti, per la pianificazione di un trattamento antibiotico ottimale del paziente; c) il test di produzione della niacina, per poter discriminare all interno del Complesso Tubercolare, tra M. tubercolosis (positivo al test) e M. bovis ed M. africanum (negativi al test). In caso di PCR per MTC (a) negativa, viene eseguito il sequenziamento della regione 16s del genoma batterico, che permette l identificazione del micobatterio non tubercolare tramite la banca dati di BLAST. In questo caso, non viene eseguito antibiogramma, in quanto questi bacilli non presentano il fenomeno della resistenza e vengono trattati con i normali antibiotici, solo su decisione del clinico sulla base delle condizioni di salute del paziente. A causa della gravità della patologia, dell elevato grado di infettività del bacillo tubercolare e dell aumentata incidenza dei casi di tubercolosi, la Regione Lombardia ha elaborato un preciso piano di sicurezza sanitaria da seguire in caso di malattia tubercolare, che prende in considerazione il paziente, i suoi conoscenti e familiari, la struttura ospedaliera ed i suoi dipendenti. Scopo di questo studio era individuare un eventuale corrispondenza tra i dati di letteratura riguardanti l epidemiologia della tubercolosi e quelli da noi 10

5 riscontrati e confrontare tra loro la microscopia, l esame colturale e la PCR, per stabilire un protocollo diagnostico tempestivo ed adeguato, a vantaggio del paziente e della comunità. Questo studio ha rivelato che la principale tipologia di campioni biologici inviati presso il laboratorio per la diagnostica della malattia tubercolare è rappresentata da quella dei campioni respiratori. Si è evidenziata un incidenza maggiore della presenza di micobatteri tubercolari e non, in particolar modo, in campioni di pazienti di sesso maschile stranieri provenienti da paesi dell Est e dell Africa, ed anziani italiani. Si è riscontrata la problematica dell elevata percentuale di contaminazione dei materiali biologici, riguardante principalmente i campioni di tipo respiratorio e provenienti da strutture ospedaliere esterne, nonostante il processo di decontaminazione. Sono stati identificati 28 campioni positivi per BAAR sui 393 analizzati, dei quali 16 risultano essere positivi per M. tubercolosis ed i restanti 11 positivi per micobatteri atipici di differenti Complessi. L esame microscopico si è dimostrato un metodo diagnostico rapido e dotato di elevata specificità per BAAR, ma ridotta sensibilità; la PCR presenta elevate specificità e sensibilità per MTC, nonché brevissimi tempi di risposta, ma non consente la valutazione della sensibilità ai farmaci del ceppo individuato, mentre l esame colturale permette l isolamento dei BAAR con lunghe tempistiche, consentendo, però l identificazione di M. tubercolosis e dei MOTT, di effettuare il saggio dei farmaci anti-tubercolari ed il test della niacina. Si è, quindi, convenuto che per una diagnostica del bacillo tubercolare completa, tempestiva ed in linea con le normative vigenti in materia, tutte e tre le tipologie di indagine sono necessarie ed indispensabili. 11