Caratteristiche Strutturali

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1 Non richiede ulteriore energia oltre a quella derivata dal movimento molecolare Richiede ATP DIFFUSIONE ENDOCITOSI ESOCITOSI Diffusione Semplice Diffusione Facilitata Trasporto Attivo SECONDARIO Crea gradienti per Trasporto Attivo PRIMARIO FAGOCITOSI Molecole attraversano il doppio strato lipidico Trasporto mediato da proteine di membrana Vescicole rivestite da membrana Caratteristiche Strutturali

2 Corso di Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia Biofisica e Fisiologia Trasporto attivo

3 TRASPORTO ATTIVO È richiesta energia metabolica (ATP) I soluti si muovono CONTRO un gradiente di concentrazione Tipi di trasporto attivo Trasporto attivo primario Trasporto attivo secondario

4 Trasporto attivo primario : l energia deriva dal legame fosfato dell ATP interessa il trasferimento contro gradiente di ioni inorganici (Na +, K + ) - pompe ioniche Trasporto attivo secondario: utilizza l energia potenziale accumulata dal gradiente di concentrazione creato dal trasporto attivo primario. (L energia spesa dalla pompa ed accumulata in forma potenziale dal gradiente creato per uno ione, viene utilizzata per operare il trasferimento contro gradiente di una seconda molecola sfruttando la tendenza dello ione a riattraversare in senso retrogrado, secondo gradiente, la membrana)

5 TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO -muove molecole attraverso la membrana citoplasmatica contro gradiente di concentrazione -non crea uno stato di equilibrio ma di dis-equilibrio rendendo la differenza di concentrazione più pronunciata (consente di creare exnovo un gradiente di concentrazione) -richiede rifornimento di energia dall esterno che deriva dal legame fosfato ad alta energia dell ATP -meccanismo del carrier flip-flop (ma i cambiamenti di conformazione richiedono rifornimento di energia dall ATP) Data l origine metabolica dell energia che li sostiene, i trasporti attivi si estinguono rapidamente per effetto di una compromissione del metabolismo cellulare, come avviene ad esempio in carenza di ossigeno (anossia), per azione di veleni della respirazione cellulare come il cianuro o il dinitrofenolo, o per abbassamento della temperatura.

6 Esempio di un trasporto attivo primario Il sistema di trasporto è un enzima che idrolizza l ATP (ATPasi) La pompa Na + /K + ATPasi consiste di 2 subunità principali (α e β) Subunità α = 1000 aa; 110 Kda contiene i siti di legame per Na + e ATP e un sito di fosforilazione nel dominio citoplasmatico; nel dominio extracellulare ha i siti di legame per il K + e la ouabaina Subunità β = 300 aa, 45 kda senza attività enzimatica e di trasporto La sua associazione con la α-subunità è necessaria per l attività della pompa in quanto stabilizza la subunità α all interno della membrana

7 La pompa, con ATP legata, lega 3 ioni Na + intracellulari La pompa cambia conformazione esponendo gli ioni Na + fuori dalla cellula dove vengono rilasciati 3 Na + fuori ATP b a 3 Na + intracell. ATP si lega alla pompa che si riorienta rilasciando i 2 ioni K + all interno della cellula P ATP viene idrolizzata, portando alla fosforilazione della subunità a della pompa Na + /K + ATPasi P P 2 K + extrac. ATP 2 K + dentro P La pompa lega 2 ioni K + extracellulari, causando la defosforilazione della subunità a

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9 il concetto di stato stazionario: La velocità con cui il Na + entra nella cellula, muovendosi passivamente secondo il suo gradiente elettrochimico, coincide con la velocità di uscita del Na + dalla cellula mediante la pompa Na + /K + ATPasi. Lo stesso dicasi per il K + Na + 3Na + 2K + 2K +

10 Regolazione della pompa Regolazione intrinseca: la cinetica di trasporto è rallentata da una diminuzione (e accelerata da un aumento) della concentrazione intracellulare di Na e di K extracellulare Adrenalina fosforilazione aumenta il rateo di trasporto della pompa ormoni tiroidei, l insulina e l aldosterone stimolano la trascrizione dei geni codificanti la proteina

11 Aspetti farmacologici

12 Pompa sodio-potassio Dal punto di vista energetico, la rilevante quantità di energia spesa dalla pompa Na + /K + per trasferire i due ioni contro gradiente si ritrova in buona parte accumulata in forma potenziale negli elevati gradienti elettrochimici che essa crea a cavallo della membrana. L importanza fisiologica del gradiente di concentrazione del sodio viene dal fatto che è una fonte di energia potenziale che la cellula può usare per altre funzioni: le cellule nervose per trasmettere segnali elettrici e le cellule epiteliali per la captazione di nutrienti, ioni e acqua. La pompa Na + /K + contribuisce al mantenimento dell equilibrio osmotico. Il blocco della pompa porta al rigonfiamento e infine alla lisi cellulare.

13 Ruolo della Na + /K + ATPasi Crea gradienti per Na+ e K+ necessari per: Potenziali d azione Potenziali sinaptici Potenziali generatori I gradienti del Na + sono importanti per i trasporti attivi secondari di: Soluti organici (glucosio, aminoacidi), Ca 2+, Cl -, H +

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16 Ca 2+ ATPasi: PMCA e SERCA Trasporti attivi primari Idrolisi di ATP accoppiata al movimento del Ca 2+ PMCA PMCA: utilizzato per espellere all esterno della cellula il Ca 2+ attraverso la membrana cellulare SERCA Ca 2+ reticolo endoplasmico SERCA: Importante per sequestrare il Ca 2+ nel reticolo sarcoplasmatico/ endoplasmatico

17 Pompa del Calcio Ha carattere di uniporto È una ATPasi Ca-dipendente detta anche Ca/Mg-ATPasi È presente sia nella membrana plasmatica (PMCA) che nella membrana del reticolo endoplasmatico (SERCA) e dei mitocondri Trasferisce contro gradiente ioni calcio dal citoplasma sia all esterno della cellula che all interno degli organuli in modo da mantenere la concentrazione citosolica di questo ione bassa (100 nm) rispetto al LEC (2 mm). Infatti, il calcio quando si trova nel citosol può stimolare vari processi come l attivazione di molti enzimi e dell apparato contrattile. Inibitore (SERCA) Tapsigargina Acido ciclopiazonico

18 Pompa di scambio H + /K +, pompa protonica -contro-trasporto primario che trasferisce ioni K + verso l interno della cellula in scambio con H + espulsi all esterno -Questa ATPasi H/K-dipendente è localizzata nelle cellule ossintiche (o parietali) delle ghiandole gastriche. Durante la digestione gastrica, essa provvede ad immettere nel citoplasma delle cellule ossintiche ioni K (presenti nel contenuto dello stomaco) in scambio con ioni H che conferiscono acidità al succo gastrico. L efficienza del processo è tale che il ph può scendere anche fino ad 1. Inibitore omeprazolo

19 TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO Consente di trasferire attraverso la membrana, contro-gradiente, molecole anche complesse, utilizzando come fonte di energia il passaggio transmembranale secondo-gradiente di uno ione che funge da motore per il trasporto stesso. La sua dipendenza (indiretta) dell attività di una pompa ionica è dimostrata dal fatto che esso viene bloccato da tutte le condizioni che bloccano la produzione di ATP come i veleni della respirazione cellulare, cianuro e dinitrofenolo. Molti di questi trasporti utilizzano quale ione motore il Na +, che è spinto ad entrare nella cellula dall elevato gradiente mantenuto dalla costante attività della pompa Na + /K +

20 2Na + glucosio Na + I - Trasporti attivi secondari basati sul gradiente del Na + alcuni esempi: Na + Ca 2+ 3HCO - 3 Na + HPO - 4 3Na + H + Na + Na + K + 2Cl -

21 Questi simporti mediano il trasporto di Glu, AA, Cl e K all interno delle cellule dell epitelio gastrointestinale e renale contribuendo al loro assorbimento L antiporo Na/H è determinante nel controllo del ph intracellulare e a livello renale permette di arricchire il liquido del lume tubulare di ioni H e di acidificare le urine. L antiporto Na/Ca ha un ruolo chiave nel controllo del Ca intracellulare specialmente a livello cardiaco.

22 Simporto Na + Glucosio Le proteine che operano questo trasporto sono denominate SGLT. Sono presenti principalmente nella membrana delle cellule assorbenti dell intestino tenue ove presiedono all ingresso nella cellula del glucosio alimentare. Analogamente sono molto presenti nelle cellule epiteliali dei tubuli contorti prossimali del rene, ove consentono il recupero della rilevante quantità di glucosio filtrato dai glomeruli (nell uomo circa 180g/24h) che non deve essere perduto con l urina.

23 TRASPORTO TRANSEPITELIALE Le molecole che passano attraverso un epitelio devono attraversare due membrane cellulari: una prima membrana quando entrano nella cellula epiteliale, e una seconda quando lasciano la cellula epiteliale per entrare nel liquido extracellulare Gli epiteli di trasporto dell intestino e del rene sono specializzati nel trasporto di molecole Le cellule degli epiteli di trasporto sono polarizzate e presentano una membrana apicale che si affaccia verso il lume dell organo rivestito dall epitelio e una membrana basolaterale che si affaccia verso il liquido extracellulare. Queste due superfici presentano proteine differenti e, di conseguenza, possiedono differenti proprietà di trasporto. La polarizzazione di queste cellule permette il trasporto direzionale di materiale dal lume verso il liquido extracellulare o dal liquido extracellulare verso il lume.

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25 Trasporto transepiteliale del glucosio dal lume del tubulo renale o dell intestino al liquido extracellulare Il glucosio entra nella cellula dal versante apicale utilizzando il simporto Na + -glucosio L Na + viene pompato fuori dalla cellula sul versante basolaterale dalla pompa Na + -K + utilizzando l energia dell ATP, mentre il glucosio diffonde verso l esterno per mezzo di un carrier per la diffusione facilitata La captazione apicale del glucosio dipende dall energia accumulata nel gradiente del sodio. Se la pompa Na + -K + smette di funzionare, il sodio entrato nella cellula non viene pompato all esterno, il gradiente del sodio non è più presente e la captazione del glucosio si arresta.

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28 Simporto Na + Aminoacidi Le proteine di questo simporto, oltre che nei microvilli del polo luminale delle cellule assorbenti degli epiteli intestinale e dei tubuli renali, operano in tutte le cellule di tutti i tessuti ove alimentano, insieme alla diffusione facilitata, la sintesi di tutte le proteine.

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30 Contro trasporto Na + /H + : partecipa alla regolazione dell equilibrio acido-base ed osmo-volumetrico di tutte le cellule. Provvede all espulsione nel LEC dell eccesso di ioni H +, liberati nel citoplasma dalle deidrogenazioni dei substrati, in scambio con l ingresso di ioni Na +, che contribuiscono al mantenimento della tonicità cellulare. Contro trasporto 3Na + /2Ca 2+ : gli ioni Na + vengono spinti dal proprio gradiente elettrochimico ad attraversare la membrana in entrata, ciò determina il trasferimento in uscita di ioni Ca 2+. Simporto Na + /K + /2Cl - : consente l entrata congiunta degli ioni Cl -, Na + e K +.

31 L antiporto Na + /H + (regolazione del ph intracelluare; anche implicato nella regolazione del volume cellulare) Na + H + K + Na +

32 Nel digiuno concorre a recuperare una frazione di NaHCO 3 proveniente dalla bile e dal succo pancreatico. La membrana luminale degli enterociti del digiuno non possiede un sistema di trasporto per HCO 3-, che deve essere disidratato a CO 2 per poter entrare sotto forma di gas nell enterocita. A ciò provvede lo scambiatore Na + /H + che trasporta nel lume intestinale gli H + necessari alla trasformazione dellhco 3- in CO 2. questa viene poi trasformata in HCO 3- all interno dell enterocita che uscirà per controtrasporto col Cl -

33 Scambiatore Na + /Ca 2+ Superficie citoplasmatica: lo scambiatore carica il Ca 2+ nonostante la bassa concentrazione, a causa della grande affinità. Superficie extracellulare: lo scambiatore carica il Na + nonostante la bassa affinità, a causa dell alta concentrazione. La transizione conformazionale comporta aumento di affinità per il Na + e diminuzione di affinità per il Ca 2+ Superficie citoplasmatica: lo scambiatore libera il Na +, nonostante la maggiore affinità, a causa della bassa concentrazione Superficie extracellulare: lo scambiatore libera il Ca 2+ nonostante l alta concentrazione, a causa della bassa affinità.

34 Antiporto Na + /Ca 2+ K + Na + Ca 2+ 3Na + Ruolo del Na + /Ca 2+ nel cuore I glicosidi cardiaci inibiscono la Na + /K + ATPasi Il Na + intracellulare aumenta diminuendone il suo gradiente di concentrazione Il Ca 2+ è espulso più lentamente dall antiporto Il Ca 2+ intracellulare aumenta e di conseguenza aumenta la forza di contrazione del cuore

35 Simporti Na + /neurotrasmettitori Azione delle droghe stimolanti sui terminali assonici catecolaminergici. Possiamo osservare un terminale noradrenergico sulla sinistra ed un terminale dopaminergico sulla destra. Sia la NA che la DA sono sintetizzate a partire da tirosina. L azione di NA e di DA si conclude normalmente con un loro riassorbimento nel terminale assonico. Cocaina ed anfetamina bloccano tale riassorbimento, permettendo a NA e DA di restare più a lungo nella fessura sinaptica.

36 Depressione la depressione è una malattia neurologica associata ad una deficienza di serotonina e noradrenalina a livello del SNC. si cura con il Prozac (fluoxetina) che inibisce il trasportatore del re-uptake (presinaptico) della serotonina rilasciata in questo modo la concentrazione di serotonina nello spazio intersinaptico e l attività delle sinapsi serotoninergiche aumentano. trasportatore (re-uptake) ACh-esterasi

37 Contro-trasporto Cl - / HCO 3 - -Riassorbimento di bicarbonato a livello della membrana basolaterale del digiuno e del tubulo contorto prossimale e distale del rene. -Ingresso di Cl esterno nelle cellule ossintiche dell epitelio gastrico, che rappresenta la riserva di Cl per la produzione di HCl. -Produzione di HCO 3 - del succo pancreatico per mantenere il ph a valori basici tale da poter controbilanciare il basso ph del chimo nel lume duodenale e a ottenere ph ottimali per il funzionamento degli enzimi pancreatici

38 Il contro trasporto HCO 3- /Cl - è tipicamente reversibile per cui opera ugualmente bene sia in ingresso che in uscita dalle cellule. Questa reversibilità è particolarmente evidente nella fondamentale funzione che esso svolge nel trasporto dei gas respiratori affidato ai globuli rossi, nota come fenomeno di Hamburger o passaggio dei cloruri.

39 TRASPORTI TRANSMEMBRANALI MEDIATI DA VESCICOLE La maggior parte delle macromolecole è troppo grande per attraversare la membrana tramite le proteine carrier, esse si muovono dentro e fuori la cellula con l aiuto di vescicole. Il processo ha carattere attivo, richiede dispendio energetico da parte della cellula Fagocitosi Endocitosi Esocitosi endocitosi recettore mediata pinocitosi

40 FAGOCITOSI E il processo con cui una cellula avvolge una particella in una vescicola. Nell uomo questo processo è limitato a determinati globuli bianchi, i fagociti, cellule che riescono ad inglobare macromolecole e corpuscoli di grosse dimensioni, come batteri e frammenti di cellule danneggiate La fagocitosi richiede l energia dell ATP per il movimento del citoscheletro e per il trasporto intracellulare della vescicola

41 ENDOCITOSI - Differisce dalla fagocitosi in quanto la superficie della membrana forma un incavo piuttosto che protrudere all esterno - E un processo attivo che richiede energia dall ATP - Non coinvolge il citoscheletro come nella fagocitosi - Può essere non selettiva permettendo al liquido extracellulare di entrare nella cellula (pinocitosi) - Può essere altamente selettiva permettendo solo a molecole specifiche di entrare nella cellula (endocitosi recettore-mediata)

42 Endocitosi OUT IN

43 Pinocitosi

44 1. I recettori proteici sulla membrana cellulare si legano al loro ligando specifico 2. Il complesso recettore-ligando migra verso una regione definita fossetta rivestita 3. La fossetta rivestita si invagina per creare una piccola vescicola rivestita da membrana 4. La vescicola si separa dalla membrana. La proteina di rivestimento si separa dalla vescicola e ritorna verso la membrana cellulare 5. La vescicola si sposta nella cellula e il recettore e il ligando si separano formando due vescicole distinte Endocitosi recettore-mediata 6. Le vescicole contenenti i ligandi si muovono verso il citoplasma dove possono essere processate dai lisosomi o dall apparato di Golgi 7. Le vescicole secretorie con i recettori tornano verso la membrana cellulare e si fondono con essa 8. La regione di fusione si apre e la membrana della vescicola diviene di nuovo parte della membrana cellulare Con questo meccanismo vengono trasportate una varietà di sostanze, tra cui ormoni proteici, fattori di crescita e proteine plasmatiche che funzionano da carrier per il ferro e il colesterolo.

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46 Esocitosi - E il modo con cui le cellule secernono grosse molecole - Richiede energia in forma di ATP - Ormoni e neurotrasmettitori attraversano la membrana con questo meccanismo -La tappa iniziale è la fusione delle vescicole secretorie con la membrana cellulare, processo che viene innescato da un aumento di calcio intracellulare - Coinvolge due famiglie di proteine Rab, che aiutano le vescicole ad aderire alla membrana, e SNARE, che facilitano la fusione delle membrane. Serve all espulsione di prodotti di scarto o alla secrezione di ormoni La membrana della vescicola secretoria si fonde con la membrana plasmatica rilasciando il contenuto all esterno