Determinazione del contenuto di licopene

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1 Determinazione del contenuto di licopene (Corso di Fisiologia della produzione e della post-raccolta) Il colore arancione, giallo e rosso di foglie, fiori e frutti è dovuto principalmente alla presenza di carotenoidi nei tessuti (i carotenoidi attualmente conosciuti sono oltre 600). Questi composti assunti con la dieta mostrano effetti benefici sulla salute umana; essendo efficaci antiossidanti (scavenger di radicali liberi), essi svolgono un ruolo importante nella prevenzione di varie patologie, in particolare di alcuni tumori, malattie cardiovascolari e dell occhio. I carotenoidi che sono stati più studiati da questo punto di vista sono il β- carotene, il licopene, la luteina e la zeaxantina. Il licopene è un carotenoide insaturo con una catena aperta (aciclico) contenente tredici doppi legami (undici coniugati e due non coniugati) (Fig. 1). Il licopene e la maggior parte dei carotenoidi delle piante si trovano nella forma trans. Nel pomodoro la forma trans del licopene rappresenta tra il 79% e il 91% del licopene totale. La trasformazione dell isomero trans in cis avviene ad opera della luce, del calore e di reazioni chimiche. Studi recenti hanno dimostrato che l isomero cis di licopene è più biodisponibile del trans, probabilmente perché la forma cis è più solubile negli acidi biliari e quindi viene preferenzialmente incorporata nei chilimicroni (lipoproteine utilizzate per il trasporto dei grassi di origine alimentare che sono sintetizzate nell intestino). Nel siero e in diversi tessuti umani la forma cis rappresenta il 50% del licopene totale. Il licopene si trova principalmente nei pomodori, nelle albicocche, nel pompelmo rosa, nella guava e nell anguria. I pomodori freschi e i suoi derivati rappresentano la fonte di licopene più importante per la dieta umana. La determinazione del licopene nei prodotti vegetali è quindi di rilevante importanza, fornendo informazioni utili da un punto di vista nutrizionale. Fig. 1

2 Mol. Ext. Coeff. x La quantificazione dei carotenoidi nei tessuti vegetali e nelle derrate alimentari viene frequentemente fatta con metodi cromatografici (HPLC), poiché ci permette di distinguere molecole con strutture chimiche simili (isomeri). L impiego dello spettrofotometro rimane tuttavia una delle metodologie più utilizzate nella chimica analitica, soprattutto quando non è necessario discriminare tra isomeri differenti e devono essere fatte analisi rapide su un numero elevato di campioni. Per la determinazione del licopene viene utilizzata una lunghezza d onda di 503 nm, che non corrisponde al picco di massimo assorbimento (circa 470 nm) ma è stata selezionata perché a questa lunghezza d onda l assorbanza di altri carotenoidi presenti nel campione è limitata (Fig. 2). licopene Wave length Fig. 2 Spettro di assorbimento del licopene in esano

3 3 Materiali: - bisturi - spatoline - navicelle - mortai e pestelli - solvente di estrazione (esano - acetone con 0,05% BHT- metanolo) - acqua distillata - beute (3 da 150 ml) - agitatore e ancorette magnetiche - pipette pasteur (vetro) - cilindro da 50 ml, 2 cilindri da 25 ml, 2 da 10 ml - 3 beaker 50 ml, 100 ml - cuvette di quarzo (o vetro) 1 ml - spettrofotometro Preparazione solvente di estrazione Esano - acetone con 0,05% BHT - metanolo (2:1:1 v/v/v). Pesare 10 mg di BHT e scioglierlo in 20 ml di acetone. Preparare 40 ml di solvente di estrazione. Metodologia A. Estrazione del campione: Frutti di pomodoro: separare il pericarpo dal tessuto loculare. Pesare 0,5 g di pericarpo (annotare il peso esatto del materiale vegetale). Omogeneizzare in mortaio con 20 ml di solvente di estrazione. Travasare in un beaker da 50 ml e lasciare in agitazione per 5 min coprendo con stagnola. Al termine dell estrazione aggiungere 3 ml di acqua distillata e lasciare in agitazione per altri 5 min (partizione). Spegnere l agitatore e aspettare la separazione delle due fasi. Prelevare 1 ml di fase apolare (esano) e trasferire in una cuvetta per fare lettura allo spettrofotometro.

4 4 B. Lettura dell'abs del licopene allo spettrofotometro : - Misurare l'abs del bianco (esano) a 503 nm ed azzerare lo strumento. - Misurare l'abs in 1 ml di campione (se l Abs > 1.2, diluire 1:2 con esano). - Fare tre letture e calcolare un valore medio di Abs. Campione Licopene replica 1: Licopene replica 2: Licopene replica 3: Abs 503 nm (1 ml) Abs media C. Calcolo della quantità totale di licopene utilizzando l equazione di Lambert-Beer : Abs = C ε l ; quindi C = Abs / ε l Abs: assorbanza C: concentrazione (M) ε: coefficiente di estinzione molare (L mol -1 cm -1 ) l: lunghezza del percorso ottico (= 1 cm) Materiale vegetale (g p.f.) = Volume di esano (ml) nel solvente di estrazione usato (2 : 1 : 1 v/v/v) = Abs media licopene = ε licopene in esano = 17, L mol -1 cm -1 P.M. licopene = 536,9 Il contenuto di licopene si calcola sostituendo il valore dell A 503 e di ε nell equazione di Lambert-Beer: A 503 Licopene (M) = = ε l A , (L mol -1 cm -1 ) 1 cm

5 5 Esempio: Abs media licopene = Licopene ( M) = = 3, moli/l (M) = 17, (L mol -1 cm -1 ) 1 cm 3,976 moli/l ( M) Per ottenere la quantità in peso (g/l), moltiplicare il valore ottenuto per il peso molecolare del licopene (P.M.= 536,9 ; 1 mole = 536,9 g): Licopene (g/l) = 3, (moli/l) 536,9 (g/mole) = 2, g/l Dato che il volume di esano nell estratto è 10 ml (10 ml / 1000 ml = 0.01), si esprime la quantità di licopene in 10 ml : Licopene ( g/10 ml di estratto) = = (2, g/l) 0.01 = 2, g/10 ml = 21.3 g/10 ml Quindi, dividere il valore ottenuto per i grammi di tessuto estratti in 10 ml (ad es g p.f.): Licopene ( g/g di tessuto) = (21,3 g/10 ml) : g = 41,7 g/g p.f. Infine, il contenuto viene espresso come mg per Kg di peso fresco di tessuto: Licopene (mg/kg di tessuto) = 41,7 g/g 1000 g = 41,7 mg/kg p.f. Licopene (mg/kg p.f.) =

6 6 Domande 1. Perchè per la determinazione spettrofotometrica del licopene viene utilizzata una lunghezza d onda di 503 nm, che non corrisponde al picco di massimo assorbimento in esano? 2. Quale è la forma più biodisponibile del licopene?