Colture in vitro di cellule e tessuti

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Faustino Antonelli
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1 Colture in vitro di cellule e tessuti

2 Le conoscenze sugli ormoni vegetali, che nella metà del 900 aumentarono notevolmente aprì nuove strade alla tecnologia delle colture in vitro. Ci si rese conto che la coltura in vitro era un formidabile mezzo per lo studio dei processi di sviluppo delle piante e di come fosse possibile stabilire a priori quale organo della pianta ottenere semplicemente dosando adeguatamente i componenti dei mezzi di coltura, in particolare gli ormoni vegetali. Successivamente, quando si comprese che non solo gli organi di una pianta potevano essere ottenuti in coltura in vitro, ma addirittura una pianta intera, a partire da un espianto piccolissimo (anche poche cellule o singoli protoplasti), il mercato delle piante di interesse agronomico e ornamentali fu completamente stravolto.

3 Nel mezzo di coltura sono sempre presenti: Macroelementi:C,O,H,N,P,S,K,Mg,Ca Microelementi: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Mo, Cl Vitamine Auxine Citochinine Zucchero Agar

4 Fu dimostrato, intorno al 1950, che un espianto midollare del fusto di tabacco era in grado di formare una gran massa di callo in presenza di auxina e citochinina a concentrazioni equimolari. In presenza di sola auxina l espianto produceva una piccola quantità di callo e da questo differenziava radici (avventizie data la loro origine). Al contrario la presenza di un alta concentrazione di citochinina ed una bassa di auxina portava alla produzione di gemme vegetative (avventizie), questo processo è detto caulogenesi. Negli anni 70 fu messo a punto un sistema sperimentale per cui pochi strati cellulari prelevati dal caule di tabacco (Strato cellulare sottile Thin cell layer) era in grado di formare, callo, radici, gemme e perfino fiori se coltivati in presenza di auxina e citochinina a concentrazioni ben precise.

6 Caulogenesi sperimentale Per caulogenesi si intende la produzione di germogli avventizi da espianti di diverso tipo o da cellule entro masse callose. Queste masse cellulari possono organizzare meristemoidi che si svilupperanno in organi (foglie e gemme ascellari) in particolari condizioni colturali.

7 La micropropagazione degli apici caulinari fa parte della caulogenesi sperimentale e rappresenta un sistema di rigenerazione Coltura di meristemi apicali. Zona meristematica dell apice caulinare, si aggiungono solitamente citochinine a basse concentrazioni. INDUCE MERICLONI Coltura di apici caulinari. Simile alla propagazione per talea, si usa una talea caulina in miniatura. La buona riuscita dipende dall espianto e dagli ormoni adatti. La produzione di germogli ascellari può essere accompagnata dalla proliferazione di gemme avventizie dal callo alla base del propagulo.

8 SISTEMI DI RIGENERAZIONE L accrescimento dell apice meristematico interviene quando il meristema apicale di un estremità del germoglio viene fatto radicare (radici avventizie) per la produzione di una plantula. Tale procedura viene impiegata principalmente per ottenere piante esenti da virus, nelle quali solo il meristema apicale (0,5mm) è rimosso assieme a poche foglie sottostanti.

9 COLTURA DI MERISTEMI APICALI RISANAMENTO DA VIRUS I virus si possono trasmettere da pianta a pianta, per contatto, per seme, per polline, per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali. Non essendo le malattie virali curabili con trattamenti in campo, l'unico modo per controllarle rimane la prevenzione. Il risanamento di piante infette prevede la coltura di meristemi apicali, che si basa sul fatto che le particelle virali sono assai rare, o disturbate nel loro metabolismo nei meristemi apicali. Essa consiste nel prelevare un apice vegetativo ed allevarlo "in vitro, in questo modo si otterrà l'intera pianta risanata ovviamente la sua condizione deve essere confermata da saggi virologici.

10 Sistemi di caulogenesi sperimentale propriamente detti Sviluppo di germogli avventizi da vari organi Sia direttamente dall espianto che indirettamente dal callo che si forma sulla superficie di taglio. I fattori che favoriscono lo sviluppo sono la scelta dell espianto e il regime ormonale. Esempi di espianto: pezzi di foglia; espianti di apici di germogli; cotiledoni, ipocotili; giovani foglie; infiorescenze immature o scapi fiorali; scaglie di bulbi, sistemi sperimentali (TCL). Sistemi di coltura di tessuti e di cellule. La coltura di cellule vegetali sia come cellule isolate (es.protoplasti), che tessuto calloso, che come sospensione liquida è un importante tecnica preliminare alla rigenerazione dell intera pianta.

ESPIANTO Si pone in coltura un espianto sterile. Fattori importanti: scelta dell espianto, eliminazione inquinanti, nutrienti, luce, temperatura e substrato.

11 ESPIANTO Si pone in coltura un espianto sterile. Fattori importanti: scelta dell espianto, eliminazione inquinanti, nutrienti, luce, temperatura e substrato. In generale, tessuti giovani, come apici dei germogli terminali o laterali o avventizi hanno capacità rigenerative migliori. Ottime anche le gemme a fiore immature.

12 Cellule private della parete PROTOPLASTI in coltura possono propagarsi indefinitamente Protoplasti di cellule del mesofillo mantenute in coltura in presenza di mannitolo per evitare la lisi.

La moltiplicazione dei germogli dipende o dalla continua formazione di

13 MOLTIPLICAZIONE Il materiale viene messo a crescere in presenza di elevati livelli di citochinina. La moltiplicazione dei germogli dipende o dalla continua formazione di germogli ascellari o dalla formazione di germogli avventizi dalle masse calliformi di tessuto alla base dei germogli.

14 Vitis vinifera Inizio coltura Moltiplicazione

15 Vitis vinifera Radicazione

16 Vitis vinifera Ambientamento

17 Espianti fogliari, coltivati in vitro sono in grado di formare gemme vegetative. Terreno MS Vitamine Auxina (IAA) 1mM Citochinina (BA) 10 mm Agar ph 5.6

19 Eventi istologici che portano alla formazione delle gemme vegetative in espianti fogliari di tabacco

20 Controllo ormonale della caulogenesi Citochinina principale induttore della caulogenesi Auxina Etilene Di per se non ha un azione induttiva di gemme vegetative, ma una variazione nei livelli di etilene riducono la risposta caulogenica. La caulogenesi indiretta, cioè mediata da callo può associarsi a variazione somaclonale

21 Variazione somaclonale Il termine somaclone fu coniato per le piante derivate da ogni forma di coltura cellulare, ed il termine variazione somaclonale fu coniato in riferimento alla variazione genetica fra queste piante

22 Di solito questa variabilità insorge spontaneamente ed è il risultato o di cambiamenti temporanei o permanenti. I cambiamenti temporanei provengono da effetti epigenetici o fisiologici e non sono ereditabili e sono reversibili. Al contrario, i cambiamenti genetici sono ereditabili e portano alla costituzione di VARIETA SOMACLONALI

23 La variazione somaclonale si associa frequentemente a caulogenesi (ed embriogenesi) indiretta Nei processi di sdifferenziamento e riprogrammazione differenti sequenze del DNA possono essere amplificate o delete. Può variare il numero e la struttura dei cromosomi, e possono sorgere irregolarità in questi, come rotture, delezioni, inversioni, formazione di cromosomi ritardatari, ad anello,ecc. I riarrangiamenti cromosomici possono risultare in perdita di geni e loro funzioni, attivazione di geni prima silenti, espressione di geni recessivi, ecc.

24 TCLs coltivati in vitro producono gemme vegetative dopo una fase di callogenesi

25 rizogensi caulogenesi Neoformazione di fiori

26 Formazione di germogli da callo Neoformazione di fiori e frutti da callo Morfogenesi indiretta L insorgenza di variazione somaclonale può essere utile!

27 Servono questi nuovi varianti??? La variazione somaclonale è una sorgente di BIODIVERSITA e serve per ottenere piante migliorate dal punto di vista nutrizionale per l uomo, più adattabili alle condizioni di coltivazione in campo, più produttive, più resistenti alle malattie.

28 In coltura in vitro è possibile indurre il differenziamento di elementi xilematici indipendentemente dall organizzazione dei fasci vascolari. Anche questo è sotto il controllo dell ormone auxina. Il processo si chiama XILOGENESI SPERIMENTALE

30 Es. di xilogenesi indotta in coltura in vitro

31 anulare elicoidale scalariforme reticolata punteggiata Meno resistenti

33 Differenziamento di una trachea Es. di morte cellulare programmata Cellula neristematica Deposizione di Degradazione del parete DNA nucleare e secondaria, degli organelli collasso del vacuolo e rilascio di enzimi litici. Formazione delle perforazioni nelle pareti trasversali necessarie per permettere il passaggiodella linfa

34 Domande: Quanti aspetti conosci di caulogenesi sperimentale? Una pianta virosata può essere risanata ricorrendo alla coltura in vitro? Quale è l ormone principale per indurre caulogenesi? La rigenerazione da apice induce variazione somaclonale? La caulogenesi da espianto fogliare o caulinare induce variazione somaclonale? La caulogenesi e la rigenerazione hanno successo senza rizogenesi avventizia? Cosa sono i protoplasti? In cosa consiste la xilogenesi sperimentale?

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