Uso di BLAST. Premessa

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1 Uso di BLAST Premessa Una delle applicazioni più semplici ed utilizzate della bioinformatica è quello di comparare 2 o più sequenze tra di loro, per ricavare delle informazioni sulla possibile funzione, o per trovare delle regioni di similarità con una sequenza sonda. Più semplicemente se abbiamo clonato e sequenziato una sequenza ignota, di solito ci interessa capire di che cosa si tratti, oppure se siamo convinti di avere clonato una determinata sequenza è utile averne conferma E possibile fare ciò attraverso una ricerca di similarità tra la nostra sequenza sonda e quelle contenute in un database pubblico liberamente accessibile, ma anche privato (ad esempio constituito da dati collezionati da un singolo gruppo di ricerca e non ancora rilasciati alla comunità scientifica). I risultati vengono poi analizzati. Se cerchiamo solo una conferma basta vedere se il risultato è coerente con le nostre ipotesi. Se invece abbiamo a che fare con una sequenza ignota, è possibile farsi un idea della sua funzione vedendo quali parti sono simili ad altre sequenze depositate nei database. Il programma più usato è decisamente BLAST, anche se per ragioni storiche va ricordato anche FASTA. Entrambi ricercano sequenze simili alla sonda, ma in modo diverso. Oggi sarà provato solo BLAST, molto più usato perché più veloce, mentre se volete potrete provare FASTA per conto vostro, in quanto un algoritmo orami superato ed importante solo per la storia della bioinformatica (è accessibile da ). BLAST (acronimo per Basic Local Alignment Search Tool) (all EBI o all NCBI) usa l algoritmo di Altschul, e si basa sul fatto che entro sequenze omologhe si possono trovare regioni con una similarità statisticamente significativa. Nei confronti nucleotidici sono attribuiti punteggi positivi alle identità e negativi alle non identità. Nei confronti proteici invece si usano matrici di punteggi PAM o BLOSUM (sulle quali non scendiamo in dettagli perché ne avrete già parlato a lezione) Si definiscono maximal score segment pair (msp) le regioni di massima similarità e high score segment pair (hsp) le regioni con punteggio di similarità statisticamente significativo. NOTA: nella maggior parte dei casi i tools messi a disposizione funzionano solo se la sequenza data è in formato FASTA. Questo formato ha soltanto la particolarità di avere una riga iniziale di commento che inizia col simbolo >. Ad esempio quella che segue è una semplice sequenza in formato FASTA: >sequenza ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC BLAST è hostato sui server NCBI ed accessibile a questo link: BLAST: NCBI NOTA BENE: BLAST è un programma che può essere anche utilizzato in locale, ovvero scaricandolo sul proprio sistema operativo e ricercando similarità in database privati.

2 Le sonde che si possono usare sono diverse, naturalmente tutto dipende da cosa si ha a disposizione e da cosa si ha intenzione di fare: cloni di cdna, sequenze genomiche ridotte, sequenze proteiche note o dedotte. Naturalmente, la natura della sequenza sonda, ovvero il fatto se si tratti di una sequenza nucleotidica o proteica, determina il tipo di blast che vogliamo utilizzare: come vedremo tra poco, esitono vari programmi, chiati BLASTn, BLASTp, BLASTx, tblastn, tblastx. Infatti, andando alla pagina BLAST dell NCBI, si vede come per ogni categoria di ricerca si abbiano più tools a disposizione. C è infatti BLASTP, che esegue una ricerca tra una sequenza aminoacidica e un db di sequenze proteiche. BLASTN, che esegue una ricerca tra sequenza nucleotidica e un database nucleotidico. BLASTX traduce una sequenza nucleotidica nei 6 frame di lettura e li compara con un database proteico, TBLASTN confronta una sequenza aminoacidica con i 6 frame di lettura di un db nucleotidico, e TBLASTX traduce nei 6 frame una sequenza nucleotidica e la compara con i 6 frame di lettura delle sequenze presenti in un determinato database nucleotidico. Parte 1 Recupero di una sequenza in formato FASTA Come prima cosa è importante sapere che le sequenze sonda vanno sempre inserite nella finestra del BLAST in formato FASTA. E piuttosto semplice ottenere una sequenza in questo formato dalle schede corrispondenti, sia dal sito dell NCBI che da quello dell EBI. Vediamo brevemente come farlo, utilizzando la sequenza nucleotidica con entry ID FR Possiamo ricercarla in entrambi i due grandi database, e vedrete che in entrambi i casi, immediatamente sotto l intestazione della sequenza, è disponibile un link clickabile FASTA, che vi restituirà per appunto la sequenza oggetto in formato FASTA. La riga di intestazione, preceduta da un simbolo >, è leggermente diversa, ma la sequenza è identica: >gi emb FR Mytilus galloprovincialis MgC1q97 gene for putative C1q domain containing protein MgC1q97 >ENA FR FR Mytilus galloprovincialis MgC1q97 gene for putative C1q domain containing protein MgC1q97 FASE 2 Ricerca di similarità di una sequenza nucleotidica utilizzando il programma BLASTN A questo punto colleghiamoci all indirizzo: Dalla pagina che si presenta scegliere il link: "nucleotide-blast. Si arriva così alla pagina del sottoprogramma di BLAST BLASTN (nucleotide BLAST) che effettua una ricerca di similarità utilizzando come "query" una sequenza nucleotidica in formato FASTA e come database un database anch esso nucleotidico. Dopo aver cliccato sul link corrispondente al programma, è possibile incollare la sequenza nucleotidica nella casella di input denominata "Enter query sequence". Il messaggio Enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence(s) ci fa capire che sarebbe anche possibile utilizzare direttamente l accession ID della sequenza, se noto (nel nostro caso sì). Ovviamente, qualora la sequenza non fosse già depositata in un database pubblico, sarebbe necessario incollarla per intero.

3 Allo stesso modo, è possibile fare un upload di un file contenente le sequenze query per effettuare BLAST multipli. Passiamo ora alla sezione sottostante, Choose Search Set. Da qui va selezionato un database all interno del quale effettuare la ricerca. Ci sono tre grandi categorie, ovvero human, mouse ed others, che a loro volta sono suddivise in database più specifici selezionabili tramite un comodo menù a tendina. Noi selezioniamo nucleotide collection (nr/nt) sotto others, la collezione di sequenza nucleotidiche non ridondanti. Notiamo poi la presenza di un campo Organism che ci permette di poter limitare la nostra ricerca a determinate specie. Per ora lasciamolo perdere, lo useremo più tardi. Segue una sezione program selection, dalla quale è possibile selezionare Highly similar sequences (megablast), More dissimilar sequences (discontiguous megablast) e Somewhat similar sequences (blastn). Questi tre programmi corrrispondono a tre gradi di sensitività diversi: Megablast è ottimizzato per sequenze molto lunghe e similarità elevate (ad esempio larghe porzioni di genoma), ottimizza il fattore velocità a scapito della sensibilità. Viceversa blastn è molto sensibile anche per similarità più remote, ma notevolmente più lento. Selezioniamo la terza opzione, Somehwat similar sequences. Sotto al tasto per lanciare il BLAST è disponibile una sezione Algorithm parameters, che ora non modificheremo ma è talvolta molto importante per ottimizzare la ricerca. Diamo comunque un breve sguardo ad alcuni importanti parametri modificabili: -Max target sequences: il numero massimo di sequenze che verrà restituito nei risultati (sempre ordinati per e-value. Le sequenze in eccesso non verranno mostrate nella pagina di output. -Expect threshold: rappresenta la soglia di e-value per mostrare un risultato: di default settata a 10, possiamo abbassarla per mostrare solamente risultati più significativi. -Word size: questo è un parametro fondamentale nel BLAST. Definisce la dimensione in caratteri di una parola, ovvero l unità basilare che è utlizzata per la ricerca di similarità in BLAST. Per la teoria su questo argomento si rimanda alle slide delle lezioni teoriche. Qui noteremo semplicemente che questo parametro varia moltissimo a seconda del tipo di BLAST (vedremo ad esempio che valore assumerà in BLASTp). -Scoring parameteres: altri parametri importanti che influenzano sensibilmente i risultati della ricerca ed il loro e-value. Definiscono, per le sequenze nucleotidiche, uno score di match/mismatch (il primo positivo, il secondo negativo) ed uno score per l apertura e l estensione di gaps, ovvero buchi nell allineamento. Per sequenze ammino acidiche la situazione sarà un po diversa, coem vedremo. E possibile inoltre introdurre dei filtri più avanzati per sequenze ripetute/ridondanti, particolarmente utili in casi ben specifici (sotto Filters and Masking). Pensiamo ad esempio alle proteine contenenti triple eliche di collagene (GGPGGPGGPGGPGGP...) oppure regioni genomiche con minisatelliti.

4 Clicchiamo sul tasto "BLAST", posto poco sotto la casella di input, per inoltrare la richiesta al server dell NCBI. Si ottiene così una pagina di attesa in cui è indicato il tempo stimato per la ricerca. Una volta terminata la ricerca, si verrà direttamente reindirizzati sulla nuova pagina contenente i risultati. Finché il server non ha terminato, compare un messaggio di attesa che si aggiorna automaticamente. NOTA: il tempo di attesa varia a seconda del carico di lavoro del server. FASE 3 Interpretazione dei risultati di BLASTN La pagina dei risultati si può dividere in quattro parti (dall alto in basso): PRIMA PARTE La prima parte dà informazioni sul programma (in questo caso BLASTN), sulla sequenza "query" (quella con cui si effettua la ricerca), tra le quali la sua lunghezza (indicata come "query length ), e sul database utilizzati. Presenta inoltre un link denominato "Taxonomy reports", da cui si arriva ad una pagina che presenta tre diverse organizzazioni dei risultati di una data ricerca effettuata con BLAST, in base all'informazione presente nel database tassonomico dell'ncbi, ed un link denominato Distance tree of results, che organizza le sequenze risultanti in semplici alberi filogenetici. Di recente è stato introdotto un altro link MSA viewer, che riporta l allineamento multiplo tra le sequenze ottenute (che esploreremo nelle prossime lezioni). SECONDA PARTE La seconda parte consiste in una immagine che illustra graficamente i risultati: la linea rossa spessa e graduata rappresenta la sequenza "query"; i numeri sotto di essa si riferiscono alla sua lunghezza in basi; ciascuna linea sottile sottostante, di vari colori, indica un allineamento della suddetta sequenza con una sequenza del database nucleotidico; il colore di tali linee indica la bontà dell allineamento, in base alla scala colorimetrica posta all inizio dell immagine (rosso migliore, nero peggiore); passando su ciascuna linea sottile con la freccia del mouse, sul riquadro subito sopra l immagine compare la descrizione della sequenza nucleotidica con cui la sequenza query si allinea in quel caso; cliccando su tali linee si va invece direttamente all allineamento (situato nella quarta parte della pagina) tra la "query" e una data sequenza del database. TERZA PARTE La terza parte consiste nell'elenco delle sequenze nucleotidiche del database scelto che producono allineamenti significativi con la sequenza "query" e comincia con la frase: "Sequences producing significant alignments:". Le sequenze sono ordinate in base all'e-value (colonna a destra), parametro che misura la significatività degli allineamenti: minore è, più significativo è l'allineamento. Ciascuna sequenza contiene un link, da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. E indicato inoltre il query cover cioè la percentuale di sequenza che trova allineamento significativo, oltre ad un livello di identità espresso in percentuale (identity). QUARTA PARTE La quarta parte visualizza gli allineamenti significativi della sequenza "query" con sequenze del database scelto.

5 Data una sequenza del database scelto che produce uno o più allineamenti significativi con la sequenza "query", come prima cosa viene visualizzata la descrizione della sequenza del database, che contiene un link, da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. Sotto la descrizione è indicata la lunghezza in basi della sequenza completa (confrontabile poi con la lunghezza dell allineamento. Successivamente vengono visualizzati il o gli allineamenti di questa sequenza con la sequenza "query". Per ciascun allineamento è indicato: "Score": è il punteggio dell'allineamento; "Expect": è l'e value dell'allineamento; "Identities": è il numero di basi identiche / la lunghezza dell'allineamento in questione; tra parentesi è indicata la risultante percentuale di identità su quella lunghezza di allineamento; "Gaps": indica il numero di gap presenti nell'allineamento / la lunghezza dell'allineamento in questione; tra parentesi è indicata la risultante percentuale di gap su quella lunghezza di allineamento; "Strand": indica l'orientamento della sequenza "query" rispetto alla sequenza del database con cui si allinea. Successivamente si ha l'allineamento vero e proprio tra la sequenza "query" e la sequenza del database in questione, denominata "Sbjct". I numeri indicano la posizione delle basi all'interno delle rispettive sequenze. Se in una data posizione dell'allineamento la base nella sequenza "query" e la corrispondente della sequenza del database coincidono, nella riga tra le due sequenze compare il carattere " ". Quando tale carattere non è presente significa che, in quella posizione dell'allineamento, la base nella sequenza "query" e la corrispondente della sequenza del database sono diverse oppure che una delle due sequenze presenta un gap. Osserviamo i risultati nel nostro caso Dall osservazione della rappresentazione grafica degli allineamenti possiamo vedere che c è un unica sequenza che dimostra altissima similarità con la nostra sequenza query, che è, naturalmente, la sequenza query stessa! Ciò è ovvio, in quanto la sequenza query stessa è depositata nel database nr/nt. Osserverò quindi un identità del 100% senza gap. Glia altri risultati dimostrano e-value molto molto minore e lunghezza dell allineamento molto breve. Notiamo brevemente i risultati e vedrete che la maggior parte dei risultati non hanno nulla a che fare con mitilo e sembrano quasi essere il risultato di similarità casuali. Scorrendo la tabella ritroviamo però qualche match che forse potrebbe corrispondere ad un hit significativo: difatti ci sono alcuni risultati che riguardano Crassostrea gigas (un ostrica, quindi un organismo non poi così lontano da mitilo) che oltretutto contengono anche la sigla C1q nel titolo. Ispezionando il risultato nello specifico però possiamo accorgerci che si tratta di una stringa relativamente breve di nucleotidi (comparata all intera sequenza query) con identità relativamente bassa. Teniamo a mente questi risultati e proviamo a passare al BLASTp.

6 FASE 4 Ricerca di similarità di una sequenza proteica utilizzando il programma BLASTP Recuperiamo la sequenza della proteina codificata dall RNA messaggero che abbiamo utilizzato fino ad ora. Ormai dovreste essere in grado di farlo con semplicità, cliccando sul link protein dalla scheda della sequenza. L accession ID della proteina è CBX Dalla pagina che si presenta scegliete il link (verso il centro della pagina): "protein blast". Si arriva così alla pagina del sottoprogramma di BLAST BLASTP che effettua una ricerca di similarità utilizzando come "query" una sequenza aminoacidica e come database un database anch esso aminoacidico. Incollate la sequenza aminoacidica nella casella di input ; come database su cui eseguire la ricerca ("Database") lasciamo "nr" (non-redundant protein sequences) (uno dei database di proteine a disposizione, sempre non ridondante). Prima di cliccare sul tasto "BLAST", posto poco sotto la casella di input per inoltrare la richiesta al server dell NCBI, osserviamo alcune altre caratteristiche della pagina, che la differenziano da quella del BLASTn. Program selection ci offre una serie di algoritmi alternativi: -BLASTp: la versione standard, che useremo ora. -PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST), di cui parleremo nella prossima lezione. Permette di creare una PSSM (position-specific scoring matrix) sulla base dei risultati di un primo BLAST per poi reiterare l analisi e renderla più specifica. -PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST): è un BLAST che limita gli allineamenti del blast a quelli che matchano un determinato pattern nella sequenza query. -DELTA-BLAST (Domain Enhanced Lookup Time Accelerated BLAST), simile a PSI-BLAST, ma che si appoggia su un database di domini conservati per la reiterazione della ricerca. Altra differenza che si può notare nella sezione Algorithm parameters è la dimensione di word size sulla base di quello che avete imparato a lezione dovreste capire il motivo di questa differenza rispetto a BLASTn. Ancora più importante, nel campo Scoring parameters è la possibilità di selezionare una matrice nel campo matrix. Da qui potete selezionare le matrici PAM e BLOSUM di cui avete parlato a lezione. A questo punto, senza modificare alcun parametro, clicchiamo su BLAST ed osserviamo i risultati. FASE 6 Interpretazione dei risultati di BLASTp La pagina dei risultati si può dividere in cinque parti (dall alto in basso), del tutto equivalenti a quelle dei risultati di BLASTN visti precedentemente. Esistono tuttavia alcune differenze osserviamole. Per ciascun allineamento è indicato, oltre ad "Identities", anche Positives": è il numero di aminoacidi identici più il numero di aminoacidi simili / la lunghezza dell'allineamento in questione; tra parentesi è indicata la risultante percentuale su quella lunghezza di allineamento; due

7 aminoacidi vengono definiti simili in base alla matrice utilizzata per l'allineamento (nel nostro caso BLOSUM62) Nel graphic summary poi è presente un show conserved domains. Vedremo tra poco di che cosa si tratta. Ma guardiamo i risultati: si trovano ora moltissime sequenze con similarità, e lungo quasi l intera sequenza. Sapete dare una spiegazione del motivo per cui questo avviene con un BLASTp ma non con un BLASTn? Proviamo a fare un ulteriore passo: torniamo alla homepage di BLASTp e limitiamo la nostra ricerca introducendo dei filtri: 1)nel menù a tendina database selezioniamo un database più piccolo, UniprotKB (che come ricorderete comprende solo un subset di proteine la cui sequenza è stata validata). 2) ESCLUDIAMO dalla ricerca mitilo e non solo, escludiamo tutti i molluschi bivalvi. Nel campo organism scriviamo Bivalvia e selezioniamo exclude dall apposita opzione sulla destra. Comparato ai risultati del BLASTn, come è spiegabile il fatto che otteniamo tutti questi risultati significativi nonostante la ricerca effettuata sia stata decisamente più stringente? FASE 7 Casi particolari (BLASTx, tblastn) Abbiamo finora visto solmente dei casi molto semplici (BLASTp e BLASTn). Ma esistono numerosi altre funzionalità che il BLAST può offrire. Ad esempio evidenziare il numero di esoni presenti in un gene che codifica per una proteina. -Ad esempio selezioniamo la proteina teletonina, che abbiamo già visto nella scorsa lezione (NP_ ). Dobbiamo scegliere attentamente il tipo di BLAST, che in questo caso sarà un tblastn (pensate ai passaggi necessari per la traduzione in proteina di sequenze nucleotidiche). Il database da selezionare è Refseq (reference genomic sequences), e specifichiamo anche Homo sapiens nel campo organism. Quanti introni interrompono la sequenza condificante la proteina? Sapete individuarne la lunghezza approssimativamente? Altro caso è quello in cui ho a disposizione una sequenza nucleotidica di cui non so nulla a parte il fatto che sia un mrna messaggero altamente espresso in un protozoo:

8 ATGAGCGGTCCATTAGTGGGGGTGGCCATTAACGACAAGTCTGCCAGGTTGGCGCGGCGTTACGCCCTTG AGTCCAACTATGACGTTGCGGTGGCCTTCTACACGGGGCTCGACAAGGATTTTGAGGTGTACATGGAGTG CTGCGAAGACGCTTCTGAGCGGGCCCGCTGGGCTCTCCTGCGTGAGAAGATCGCCGAGGAGTGCTCTCTC GTACGCTCCATCCAGGAGGAGCTCAAGGCGCTAGTGAACCCGGTGGAGGCGGCGCGGCTGGAACGTGCGC AGCAGGGTGACAGCGGCGTGGCGCAAGTGTCGCCGCCCAGGCCTCGCGTGGCACGTGACTCGTATCCAGG ACGTGCAGCAACGACACGGCCCGCGCGCCCCACCGGTTTCCGAGCAACCAACACGGCTACCTCGGCCTCG CCCCCGCCGGCCCTTCACCGCGCCGCAGAGAGTGCCGGGGCGCTCAACCAGGTGCTATATGGAGATAAAG ATCGATTTGGCCCTCCAGAGGGGCCAGCTATCAAGCCGCAGCCGCGGCCAGGTGGAGTGTCCAAGCCATC ACAACGCCACAGCTCCCCTGCTTTTCGCAGGGGTGCACCTGCAGGGGGTGCATTGACAAAGCCGTCCTCT CCTCTTAGTAACGCCAAGGCTAAGGTGGTCACGCGGCGTGCAGAGAAACCCGCGGACGGTGGCGGACGTC GTCAGGGAACGCGGACCACTGTCCCGCGTTTTGCTCCACGCAGTGGAGAAGAAGAGTTAGTCTCACTCAT CGAGGCGGACATGCACGTTGGCCCAACGTCCTTGTCGTGGGCTGATATTGCTGGGCTAGAAGAGGCCAAA GGGCTACTTGAGGAGGCTGTTGTCTACCCGGTGCTGATGCCGGATTACTATCAGGGAATCCGGCGACCAT GGAAGGGGGTTCTCCTGTACGGGCCACCTGGGACGGGAAAAACAATGCTCGCTAAGGCGGTCGCGTCGGA GTGCAACACAACTTTCTTCAATATCTCACCCGCTACCTTAACCAGTAAGTGGCGCGGTGATAGCGAGAAA CTTATCCGGATTCTTTTTGAGATGGCACGACATTACGCACCGAGTACCATATTTATTGACGAAATTGATT CCCTGTGTGGGCAGCGGGGAGATGGGGGCGAGCATGAGGCCTCGCGCCGTGCGAAAGGGACGTTACTAGC CCAGATGGATGGTGTTGGTGTTGATCCTGGAAAGATAGTCATGGTTTTGGGCGCCACAAATCATCCGTGG TCTATCGACGAGGCGATGCGTCGCCGATTGGAGAAACGTATATACATTCCTCTTCCAGATTTCAACGATC GTGTGGAGCTCTTCCGCATCAACACCCAATCGCTGAAGTTGTCTTCCGACGTGGACTTTAAACGCCTGTC GACGATGCTGGAGGGTAGACACTACAGTTGTGCCGACATTACAAATCTAGTGCGTGACGCGGCGATGATG ACGATGCGGCGCTTCAGGGAGGAAATGGACAAGTCAGAGCTCAAACGACGCGCGGCAGAAATTGGCAAGC TGGTGGCAGACCAGCCAACGACTATGAATGACTTCCTGAGTGCTGTGAAGAATGTGCCGAGCAGCGTCAA CGTGGAGCAGATCGTGAAGTTCGAGAAGTGGAAGAAAGAGTTCGAGACAAACGTGTAG Posso confrontare questa sequenza con un database proteico di riferimento, magari UniprotKB che racchiude proteine la cui funzione è stata già più o meno definita. Naturalmente in questo caso dovrò selezionare BLASTx. A quale funzione può essere ricondotta la proteina codificata dal messaggero ignoto? FASE 8 Allineamento tra due sequenzetramite Blast2seq Dalla pagina dei risultati di BLASTP vista precendentemente per la proteina di mitilo individuare l'allineamento di MgC1q97 con la proteina adiponectin [Macaca fuscata], che ha accession ID BAG Cliccate sul link che porta al record di Entrez relativo e recuperarne la sequenza aminoacidica in formato FASTA. Siamo interessati a capire qualcosa di più sulla similarità tra questa sequenza e la sequenza query. Ad esempio, dove è concentrata la similarità? Una sequenza è decisamente più lunga dell altra, quindi è intuitivo che quella di mitilo (la più lunga) contiene una porzione di sequenza aggiuntiva e noi vogliamo capire quale è. Dalla pagina principale del BLASTp, sotto la finestra in cui incollare la sequenza, possiamo selezionare il box Align two or more sequences. Comparirà una seconda finestra in cui sarà possibile incollare una seconda sequenza da confrontare con la prima, tramite uno strumento noto con il nome Blast2seq. Incolliamo la sequenza di mitilo CBX nella prima finestra e quella di macaco (BAG ) nella seconda. NOTA BENE: è possibile incollare anche solamente l accession ID delle 2 sequenze.

9 Cerchiamo di interpretare l output dal campo alignments l output grafico apparentemente non ci permette di capire esattamente quale sia la situazione! Provate ora a cliccare su Dot matrix view. Il grafico traccia una retta nelle regioni in cui c è un allineamento significativo tra le due sequenze. Sugli assi X e Y sono riportate le posizioni (in questo caso in residui ammino acidici) delle due sequenze in esame. Pertanto, le corrispondenze corrispondono a rette con coefficienti angolari positivi. Laddove la retta è spezzata e si sposta con uno scarto c è un gap nell allineamento. Inversioni (solo in sequenze nucleotidiche) saranno indicate da segmenti di retta con coefficiente angolare negativo. Cosa vi potete aspettare invece nel caso di ripetizioni? Le tre rette parallele che riuscite ad identificare a che cosa corrispondono nel campo alignments? Avete qualche ipotesi per spiegarvi il motivo di questa particolare rappresentazione nel caso dell allineamento tra la sequenza di mitilo e quella di macaco? FASE 9 Individuazione di domini proteici NOTA BENE: Anticiperemo una breve parte pratica che farà riferimento ad una parte teorica che tratteremo nella prossima lezione. La determinazione della presenza e della posizione dei domini proteici può essere estremamente utile per darci un aiuto fondamentale a comprendere meglio i nostri risultati. Per dominio proteico si intende una porzione conservata di una proteina (e quindi anche un unità strutturale) che può evolvere ed esistere separatamente dal resto della catena proteica. DI solito un dominio proteico ha anche una determinata struttura che è evolutivamente conservata ed una funzione ben determinata. Ad esempio un dominio EF-hand lega ioni calcio. SI tratta di un dominio estremamente comune (presente in migliaia di proteine diverse), che mantiene questa funzione indipendentemente dalla localizzazione subcellulare e da eventuali attività catalitiche e di altro tipo di legame del resto della proteina a cui è associato. NOTA BENE: un concetto simile può essere trasportato anche sulle sequenze nucleotidiche, che spesso sono caratterizzate da determinati motivi e sequenze consensus che svolgono una determinata funzione. Ad esempio immaginiamo promotori, enhancer, repressori, la stessa TATA box, ma anche siti di splicing. Ognuna di queste sequenze deve poter essere riconosciuta da determinate proteine (ad esempio fattori di trascrizione, enzimi deputati al taglio, ecc.) e pertanto devono avere un consensus relativamente conservato e, talvolta, corrispondono a dei ripiegamenti strutturali ben determinati. Oggi, per semplicità, ci occuperemo di tools dedicati all identificazione di domini proteici, ma tenete a mente che esistono anche tools per identificare motivi conserrvati anche in sequenze nucleotidiche e sono fondamentali, ad esempio per la predizione di geni, trascritti, introni ed esoni nei genomi. Interpro Interpro è una risorsa bioinformatica, sviluppata all'ebi, che consente di ricercare informazioni funzionali e strutturali relative a una proteina o a una famiglia di proteine interrogando contemporaneamente più banche dati, distribuite su calcolatori diversi e strutturate in modo differenti.

10 I Database integrati in InterPro sono: PROSITE, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART, TIGRFAMs, PIR, SUPERFAMILY, Gene3D, PANTHER e HAMAP. Tutti questi database sono anche consultabili separatamente e presentano delle schede proprie, Interpro ha proprio il merito di collegare ed uniformare I risultati delle ricerche in questi database. Colleghiamoci a e incolliamo nella finestra la sequenza di mitilo. Apriamo un altra finestra ed incolliamo anche quella di macaco. Aspettiamo qualche decina di secondi fino al completamento dell analisi e commentiamo i risultati. I risultati sono organizzati in Entry type, divisi in tre categorie: 1) Family 2) Domains 3) Repeats. Family identifica una famiglia di proteine accomunate da una funzione comune o da un origine evolutiva comune. In sostanza, le entry di questo tipo dovrebbere essere di aiuto per identificare grossi gruppi di sequenze ortologhe e paraloghe con un buon grado di confidenza e di solito le annotazioni ricoprono l intera sequenza. Molto spesso la similarità di una sequenza non è sufficientemente elevata per raggiungere una classificazione così affidabile e pertanto questo campo talvolta è vuoto. Domains ci riporta i domini proteici identificati (se presenti) e quindi si dovrebbe trattare di annotazioni che comprono soltanto una parte della sequenza (corrispondente proprio al dominio identificato). E molto comunque ed assolutamente possibile ritrovare più domini in una stessa proteina, talvolta anche sovrapposti gli uni agli altri. Repeats presenta eventuali sequenze ripetute trovate nella sequenza. Un esempio classico è il collagene, non un vero e proprio dominio strutturale, ma una sequenza a bassa complessità ripetitiva con elevata percentuale di residue di glicina e prolina. C è poi una sezione Sites che riporta altre annotazioni di siti e domini non integrati nelle precedenti tre categorie, ma non scenderemo molto nel dettaglio di questa categoria. Sappiate però che in questa sezione sono integrati i risultati di SignalP (per la predizione del peptide segnale per la secrezione) e TMHMM (per la predizione di domini transmembrana). In questa lezione tralasciamo quindi tutte queste informazioni accessorie raccolte nel campo Unintegrated, che possiamo quindi deselezionare dal box presente a sinistra. Passiamo ora all interpretazione dei risultati: quali e quanti domini sono identificabili nelle due sequenze: vi potete spiegare ora meglio il dot box plot visto prima per il Blast2seq? Notiamo alcune cose importanti: 1) Domini e famiglie sono identificati da sigle identificative precedute dal prefisso IPR. E possibile cliccare sui link corrispondenti per trovare più informazioni a riguardo di questi domini e anche le relazioni con altri domini ed il numero di proteine annotate contenenti i domini in questione nei database pubblici. 2) Ad ogni dominio IPR corrispondono svariate entry di altri database: ad esempio, al dominio C1q corrispondono entry con prefissi PF, PR, PS e SM. Cliccando su questi link verrete riportati a schede esterne dei database SMART, PFAM, Prosite, ecc.

11 3) Esistono in alcuni casi domini sovrapposti, come il C1q ed il TNF-like in questo caso. Questo perché alcuni sono domini più generalizzati, altri ben più specifici. Ina ltre parole un dominio C1q sarà sempre riconosciuto come TNF-like, ma non viceversa. Ma ispezioniamo più nel detaglio le informazioni contenute in Interpro: prendiamo come esempio appunto, il dominio C1q. Cliccando sul nome del dominio ( possiamo raccogliere molte informazioni sulle sue funzioni, sulla sua distribuzione tassonomica, sull associazione con altri domini, ecc. Ad esempio sulla sinistra Proteins matched ci dice che sono registrate oltre 5000 proteine contenenti questo dominio nei database pubblici. Ci possiamo quindi chiedere se il nostro caso, con tre domini C1q in serie, sia l organizzazione proteica più frequentemente osservata oppure no: cliccando su domain architechtures posso verificarlo. Infine da species posso osservare se vi sia un disribuzione tassonomica uniforme o meno negli organismi viventi. Con un pò di conoscenza di tassonomia è possibile trovare quante siano le proteine con domini C1q presenti nell uomo (per nostra fortuna già riassunte in tabella) o in mitilo.