VARIABILITÀ DEL PROFILO ACIDICO DEL LATTE OVINO PRODOTTO IN SARDEGNA: POTENZIALITÀ DELLA SPETTROSCOPIA FT-MIR
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- Fabio Riccio
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1 VARIABILITÀ DEL PROFILO ACIDICO DEL LATTE OVINO PRODOTTO IN SARDEGNA: POTENZIALITÀ DELLA SPETTROSCOPIA FT-MIR Marco CAREDDA *1, Ignazio IBBA 2, Danilo MUGGIANU 2, Gavino NIEDDU 3, Giovanni PIREDDA 1, Maria Francesca SCINTU 1, Gavino SANNA 4, Margherita ADDIS 1 RIASSUNTO - L impiego di metodi spettroscopici aspecifici on-line per l analisi degli alimenti è in costante crescita. In tale ambito, l applicazione di metodi spettroscopici nel medio infrarosso (FT-MIR) abbinati all analisi multivariata permette di ottenere modelli che predicono, in maniera pressoché istantanea e con un basso costo per campione ma senza detrimento per l accuratezza, la concentrazione degli analiti nella matrice studiata. Consapevoli del crescente significato che il profilo acidico del latte (o quantomeno le sue classi costituenti) ha nell ambito della valorizzazione della materia prima o dei suoi prodotti di trasformazione, l obiettivo del presente studio è stato quello di cercare di oggettivarne la variabilità, su latte ovino prodotto in Sardegna, mediante tecniche spettroscopiche online FT-MIR. Lo studio è stato effettuato su circa 6000 campioni di latte ovino, prelevati tra il febbraio ed il giugno 2012 da diversi allevamenti situati nelle province di Oristano, Nuoro e Cagliari. Per ogni campione è stato acquisito lo spettro FT-MIR tramite uno spettrometro Milkoscan FT-6000 in dotazione al Laboratorio del latte dell Associazione Regionale Allevatori (ARA) della Sardegna. Il tenore di grasso e la concentrazione delle principali classi degli acidi grassi: saturi (SFA), insaturi (UFA), monoinsaturi (MUFA) e polinsaturi (PUFA) è stato quindi valutato tramite modelli di predizione basati su regressione multivariata PLS (Partial Least Square regression) in precedenza messi a punto e validati dal nostro gruppo di ricerca. I valori ottenuti in predizione sono stati elaborati tramite analisi delle componenti principali (PCA). I risultati hanno permesso di evidenziare le differenze compositive del latte ovino dovute a variabilità sia geografica che stagionale. Di rilievo è la separazione che si osserva tra i campioni di latte di fine inverno e di fine primavera, e quella che si nota tra i campioni provenienti da allevamenti situati in montagna ed allevamenti situati in pianura. Parole chiave: latte ovino, profilo acidico, spettroscopia FT-MIR, Analisi delle Componenti Principali (PCA) * Corrispondenza ed estratti: caredda.m@gmail.com 1 Dipartimento per la Ricerca nelle Produzioni Animali. Agris Sardegna. Loc. Bonassai 07040, Olmedo, Italy 2 ARA, Associazione Regionale Allevatori della Sardegna, Laboratorio Analisi Latte. Via Cavalcanti 8, , Cagliari, Italy 3 CAO, Cooperativa Allevatori Ovini. Loc. Perda Lada Fenosu, 09170, Oristano, Italy 4 Dipartimento di Chimica e Farmacia, Università degli Studi di Sassari Sassari, Italy Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2),
2 SUMMARY - Variability of fatty acids profile in Sardinian sheep milk by FT-MIR spectroscopic techniques. - The use of on-line aspecific spectroscopic methods in food analysis has been constantly increasing. Mid-InfraRed (MIR) spectroscopic methods, combined with multivariate analysis, has been used to build models that predict the concentration of an analyte in a food matrix with good accuracy, in real time and at low cost. Been aware of the growing importance of the fatty acid profile (at least in the categories of fatty acids) in the enhancement of milk and its products, the aim of this work was to make objective the fat variability of Sardinian sheep milk by using FT-MIR spectroscopic techniques. The study was conducted on around 6000 Sardinian sheep milk samples collected between February and June 2012 in different farms of the areas of Oristano, Nuoro and Cagliari. The FT-MIR spectrum of each sample was acquired by using the spectrometer MilkoScan FT-6000 (FOSS) used in the Milk Laboratory of the Regional Breeding Association (ARA Sardegna). Total fat and the classes of Saturated Fatty Acids (SFA), Unsaturated Fatty Acids (UFA), Mono- Unsaturated Fatty Acids (MUFA), and Poli-Unsaturated Fatty Acids (PUFA), were estimated by using Partial Least Squares (PLS) models previously built and validated by our research group. The predicted values were analyzed by the Principal Component Analysis (PCA) which has allowed to evidence differences between samples in relation to geographical or seasonal variability. The greatest separation has been noted between the samples of late winter and early summer and between samples gathered, in the same period, in farms that differ for altitude (high altitude, defined as mountain, versus low altitude, defined as plane ). Keywords: sheep milk, fatty acid profile, FT-MIR spectroscopy, Principal Component Analysis (PCA) INTRODUZIONE Da qualche decennio si va sempre più diffondendo nel settore dell analisi degli alimenti l impiego di metodi analitici on-line. Tali tecniche sono solitamente di natura spettroscopica e la loro adozione, se coadiuvata da un approccio chemiometrico di elaborazione dei dati ottenuti, permette di stimare in tempo reale, con accuratezza, in maniera non invasiva e non distruttiva e con un basso costo per campione, la concentrazione di più analiti (in genere maggioritari) su di una matrice alimentare. Tra le tecniche maggiormente utilizzate in questo senso spicca la spettroscopia infrarossa a Trasformata di Fourier (FT-IR). Lo spettro FT-IR così ottenuto è caratteristico degli analiti presenti in ciascun campione di una specifica matrice alimentare, ma ha necessità di esser sottoposto ad un opportuno trattamento chemiometrico dei dati in esso contenuti al fine di poterli rendere correlabili alle concentrazioni degli analiti in esame. Tale risultato viene solitamente raggiunto elaborando modelli di predizione ottenuti con una regressione parziale dei minimi quadrati (PLS) tra gli spettri FT-IR acquisiti su una popolazione di campioni reali, e la concentrazione vera dell analita (o degli analiti) in esame, misurata tramite metodi analitici tradizionali ed opportunamente validati. I modelli così costruiti possono quindi essere utilizzati per stimare la concentrazione dell analita in campioni incogniti della stessa matrice a partire dal loro spettro infrarosso [1]. Nella matrice latte sono comunemente applicate metodiche FT-IR validate per la stima del tenore di grasso, di proteine e la concentrazione di lattosio [2]. Questi metodi vengono attualmente utilizzati in Sardegna sia nei sistemi di controllo del latte ovino eseguiti dall Associazione Regionale Allevatori (ARA, Sardegna) che nel sistema di remunerazione del latte basato sulla sua qualità. Scopo del presente contributo è quello di cercare di estendere l applicabilità delle metodiche FT-IR, prima menzionate, alla predizione delle principali categorie di acidi grassi presenti in oltre 6000 campioni di latte ovino provenienti da numerose aree 52 Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2), 51-57
3 geografiche della Sardegna durante tutto il periodo di lattazione dell anno MATERIALI E METODI Campionamento Un totale di 6253 campioni di latte ovino sono stati prelevati dall Associazione Regionale Allevatori della Sardegna (ARA Sardegna), nel periodo compreso tra febbraio e giugno 2012, in numerosi allevamenti della Sardegna situati in diverse aree delle province di Oristano, Nuoro e Cagliari. Nel dettaglio, 2050 campioni sono stati raccolti nell area della Pianura di Oristano, 963 campioni nell area dell Alto Oristanese, 1250 campioni nella zona del Montiferru, 784 campioni nella zona del Barigadu, 273 campioni nella zona della Marmilla, 360 nella zona dell Alta Marmilla, 120 nella zona del Trexenta, 128 nella zona della Barbagia e 315 nella pianura del Campidano di Cagliari (Fig. 1). I campioni di latte sono stati trasportati nell arco di 4 ore, ad una temperatura di 4 C, al Laboratorio del Latte dell ARA Sardegna. Strumentazione Lo Spettrometro Milkoscan FT-6000 (FOSS) è stato utilizzato per acquisire lo spettro FT-MIR di ogni campione di latte Figura 1 - Aree di campionamento Figure 1 - Sampling areas Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2),
4 ovino. Lo spettro è stato registrato nella regione infrarossa compresa tra 925,92 e 5011,54 cm -1. La risoluzione spettrale è di 3,858 cm -1 per cui ogni spettro consta di 1060 punti. Analisi del profilo acidico del latte Tramite modelli di predizione, costruiti e validati precedentemente per mezzo di una regressione multivariata PLS (Partial Least Square regression) (FIL-IDF 141C:2000, software WinISI 3.0) sono stati stimati i valori del grasso totale (g/100 ml di latte) e delle classi di acidi grassi saturi (SFA), insaturi (UFA), monoinsaturi (MUFA) e polinsaturi (PUFA). I valori predetti delle classi di acidi grassi sono stati convertiti in g/(100g di metil esteri degli acidi grassi) [3]. Analisi statistica L analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita sui valori predetti, autoscalati, del grasso totale e delle classi SFA, UFA, MUFA e PUFA, utilizzando il software basato sul linguaggio R sviluppato dal Gruppo di Chemiometria della Divisione di Chimica Analitica della Società Chimica Italiana, scaricabile gratuitamente dal sito gruppochemiometria.it. Utilizzando i criteri diagnostici T 2 e Q, che misurano rispettivamente l influenza sulla costruzione delle componenti principali e la quantità di varianza non spiegata dalle componenti, per ogni singolo campione, 24 di essi sono stati considerati outliers e rimossi dal dataset. RISULTATI E DISCUSSIONE Le medie dei valori predetti del grasso totale e delle classi di acidi grassi dei campioni di latte ovino analizzati, divisi per zona di campionamento, sono mostrati in tabella 1. I valori stimati di grasso totale e delle classi SFA, MUFA, PUFA e UFA dei singoli campioni di latte provenienti da ogni area geografica sono stati elaborati tramite analisi delle componenti principali (PCA). Come esempio, in figura 2 sono mostrati il grafico degli scores (a) ed il rispettivo grafico dei loadings (b) ottenuti per i campioni dell area geografica Trexenta. I campioni sono codificati per mese di raccolta. L esame dei due grafici consente di evidenziare l andamento Tabella 1 - Dati medi e deviazioni standard dei parametri predetti suddivisi per area geografica Table 1 - Average values and standard deviations of the predicted parameters, grouped for geographical area 54 Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2), 51-57
5 Figura 2 - Score (a) e Loading (b) plots ottenuti nella PCA del profilo acidico dei campioni dell area geografica Trexenta Figure 2 - Score (a) and Loading (b) plots of the PCA obtained for the fatty acids profile of the samples belonging to the geographical area Trexenta stagionale dei parametri presi in esame. Tale variabilità è descritta prevalentemente dalla prima componente principale (PC1). I campioni del mese di febbraio sono generalmente caratterizzati da valori intermedi dei diversi parametri, presentando però in alcuni casi anche i valori più elevati degli SFA. I campioni del mese di marzo presentano valori di scores negativi sulla PC1, e sono quindi caratterizzati da bassi valori di grasso, di UFA e di MUFA che presentano invece loadings positivi su tale componente. Nel mese di aprile si osservano, invece, le maggiori concentrazioni di PUFA (scores e loadings negativi su entrambe le componenti) e le minori di grasso totale, che invece tendono rispettivamente a diminuire e ad aumentare nel mese di maggio. Ad inizio estate (giugno) i campioni di latte presentano valori di scores positivi sulla PC1 e sono quindi caratterizzati dalle più alte concentrazioni di grasso, di UFA e MUFA e dalle più basse di SFA e PUFA. L andamento del tenore di grasso evidenziato dalla PCA ricalca la classica variazione stagionale di tale parametro nel latte di pecora di razza Sarda. La diminuzione degli SFA e l aumento degli UFA durante il periodo di lattazione potrebbe invece essere legato ad un possibile cambiamento della razione alimentare degli animali causato dal naturale decadimento qualitativo del pascolo con l avvicinarsi della stagione estiva. La diversa composizione della razione alimentare potrebbe aver inibito la sintesi de novo degli acidi a corta e media catena (<C16:0), che rappresentano una buona quota degli SFA [4], e contemporaneamente potrebbe aver favorito una mobilizzazione del grasso corporeo con liberazione di acidi grassi monoinsaturi ed in particolare di acido oleico (C18:1 9 cis) [5]. La migliore qualità dell erba nella stagione primaverile, in termini di acidi grassi precursori (linoleico e linolenico), spiegherebbe il maggior contenuto di acidi grassi polinsaturi (PUFA) che caratterizza il latte del mese di aprile. In figura 3 sono mostrati il grafico degli scores (a) ed il rispettivo grafico dei loadings Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2),
6 Figura 3 - Score (a) e Loading (b) plots ottenuti nella PCA del profilo acidico dei campioni delle aree geografiche pianura Campidano di Cagliari (C) e Barbagia (B), raccolti nel mese di febbraio Figure 3 - Score (a) e Loading (b) plots of the PCA obtained for the fatty acids profile of the samples belonging to the geographical areas Campidano di Cagliari plane (C) and Barbagia (B), gathered in February (b) dei campioni raccolti, nello stesso periodo (febbraio), in due diverse aree geografiche dell Isola che differiscono per altitudine, per conformazione pedologica nonché per diverse condizioni microclimatiche: pianura del Campidano di Cagliari (C) e Barbagia (B). I campioni di latte delle due aree geografiche sono parzialmente separati lungo la seconda componente principale (PC2), quasi totalmente decritta dal tenore di grasso. I campioni di latte provenienti dalla Barbagia sono quindi caratterizzati da un maggiore contenuto di grasso rispetto a quelli prelevati in pianura. SFA, UFA e MUFA presentano, invece, bassi valori di loadings lungo la PC2 per cui tali parametri non contribuiscono alla separazione tra i campioni delle due zone. I PUFA contribuiscono in parte alla costruzione della PC2, ed in generale i campioni del gruppo della pianura del Campidano di Cagliari ne presentano concentrazioni più elevate. La differenza del tenore di grasso tra i due gruppi di campioni potrebbe essere legata ad un effetto di concentrazione dei macrocostituenti nel latte, proveniente dagli allevamenti situati in "montagna", poiché presumibilmente caratterizzati da livelli produttivi inferiori rispetto agli allevamenti posti in pianura. L elevata presenza di erbai, anche di leguminose, ricche in acido linolenico [6], nei pascoli della pianura del basso Campidano potrebbe invece giustificare il maggiore contenuto di acidi grassi polinsaturi (PUFA) che contraddistingue il latte di questa zona geografica. CONCLUSIONI L elaborazione multivariata dei parametri predetti, in tempo reale e a basso costo, tramite spettroscopia FT-MIR, ha permesso di evidenziare le differenze compositive del latte ovino a livello di classi di acidi grassi dovute sia a variabilità geografica che stagionale. Visti i risultati ottenuti e le elevate potenzialità applicative del metodo, si stanno attualmente sviluppando dei modelli di pre- 56 Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2), 51-57
7 dizione dei principali acidi grassi individuali nel latte ovino. I nuovi modelli verranno testati in modo da valutare il loro possibile utilizzo nei controlli legati al sistema di pagamento a qualità del latte ovino in Sardegna. Ringraziamenti: Poster presentato al 4 Congresso Lattiero-Caseario AITeL, Padova 12 settembre 2014 Latte e derivati: la ricerca e l innovazione. BIBLIOGRAFIA 1) Irudayaraj J, Reh C (2008) Nondestructive Testing of Food Quality. IFT Press and Blackwell Publishing 2) ISO, Whole milk - Determination of milk fat, protein and lactose content - Guide for the operation of mid-infrared instruments (FIL-IDF 141C:2000) International Organization for Standardization, Brussels, Belgium 3) New applications of Mid Infra-Red spectrometry for the analysis of milk and milk products (2010) Bulletin of the International Dairy Federation 447/2010 4) Chilliard Y, Ferlay A, Doreau M (2001) Effect of different types of forages, animal fat or marine oils in cow s diet on milk fat secretion and composition, especially conjugated linoleic acid (CLA) and polyunsaturated fatty acids. Livest Prod Sci ) Chilliard Y, Ferlay A, Rouel J, Lamberet G (2003) A review of nutritional and physiological factors affecting goat milk synthesis and lipolysis. J Dairy Sci ) Addis M, Cabiddu A, Pinna G, Decandia M, Piredda G, Pirisi A, Molle G (2005) Milk and Cheese Fatty Acid Composition in Sheep Fed Mediterranean Forages with Reference to Conjugated Linoleic Acid cis-9,trans-11. J Dairy Sci Caredda et al (2015) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 66 (1-2),
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