L importanza della biologia individuale nell impiego clinico dei marcatori di neoplasia ovarica Federica Braga

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1 L importanza della biologia individuale nell impiego clinico dei marcatori di neoplasia ovarica Federica Braga Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica e Cattedra di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica, Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università degli Studi di Milano

2 Antigene Carboidratico 15 (CA15) glicoproteina (>00 kda), riconosciuta da CO15, principalmente espressa dai tessuti di origine Mülleriana marcatore consolidato per la determinazione della recidiva di carcinoma ovarico e il monitoraggio della risposta alla terapia Linee Guida NICE 011: utilizzo in primary care setting per donne con sintomi suggestivi o ad alto rischio per carcinoma ovarico Proteina 4 dell epididimo umano (HE4) glicoproteina (0-5 kda) appartenente alla famiglia four-disulfide core proteins. Presenta omologie con alcuni inibitori di serinproteasi a parità di sensibilità, HE4 mostra una specificità significativamente più alta rispetto a CA15 per la diagnosi di carcinoma ovarico

3 HE4 supera CA15 in termini di accuratezza diagnostica per l identificazione di carcinoma ovarico in donne con sospetta sintomatologia Il CA15 verrà sostituito da HE4? possibile, ma prima bisogna meglio comprendere e definire: prestazioni analitiche strategie di interpretazione VARIABILITA BIOLOGICA TRAGUARDI ANALITICI INTERPRETAZIONE

4 Variabilità totale Preanalitica Analitica Biologica Intraindividuale Interindividuale (Fraser & Harris, 1989) Traguardi analitici (imprecisione, bias, errore totale della misura) Utilità dei limiti di riferimento (indice di individualità) & numero di campioni da esaminare per determinare il punto omeostatico Differenza critica ( reference change value ) 4

5 Variabilità Biologica CA15: Limitazioni dei dati disponibili raccolta campioni seriali a distanza di tempo variabile, anche durante il periodo mestruale [1-3] no distinzione tra donne PreM e PostM [1-3] arruolamento di soggetti con condizioni potenzialmente interferenti (es. portatori di altre neoplasie) [3] campioni analizzati in più sedute analitiche [1,3] nessuna informazione sulla distribuzione dei dati [1-3] [1] Browning MC et al. J Nucl Med Allied Sci 1990;34 (Suppl):89s-91s [] Tuxen MK, et al. Gynecol Oncol 1999;74:1- [3] Trapé J, et al. Clin Chem 005;51:19-

6 Variabilità Biologica HE4: Nessun dato disponibile in letteratura

7 OBIETTIVO DELLO STUDIO Determinare la VARIABILITA BIOLOGICA di CA15 e HE4 nella stessa coorte di donne, suddivise in pre- e post-menopausa*, attraverso un protocollo estremamente accurato Particolare attenzione alle fonti di variabilità pre-analitica e all analisi statistica. *Stato menopausale definito come amenorrea da oltre 1 mesi per cause naturali [Nurses Health Study] 7

8 MATERIALI E METODI 8 donne apparentemente sane: 14 prem (età 5-53 anni) 14 postm (età anni) CRITERI DI INCLUSIONE: - nessuna storia di malattia cronica; - ciclo mestruale regolare e no uso contraccettivi; - no farmaci, alcol (>10 g di etanolo/g), fumo. 4 prelievi di sangue venoso, uno al mese (durata dello studio: 4 mesi) PRELIEVO: - donne PreM: 1-14 g del ciclo (ovulazione) - tra 09:00 e 09:30, digiuno almeno 8 h; - no attività fisica 4 h precedenti; - stesso prelevatore; - provette da siero senza gel separatore; - centrifuga, aliquotazione e conservazione a -80 C. 8

9 MATERIALI E METODI scongelamento e risospensione di tutti i campioni analisi in: - UNICA SEDUTA ANALITICA - DUPLICATO - ORDINE CASUALE utilizzo di un singolo lotto di reagenti Analizzatore ROCHE Modular analytics EVO (electrochemiluminescent immunoassay) 9

10 ANALISI STATISTICA (I) TEST per OUTLIER (Cochran s test, Reed s criterion) TEST di NORMALITA DELLA DISTRIBUZIONE (Shapiro-Wilk test e Kolmogorov-Smirnov test) Varianza Analitica ANOVA per derivare CV A %, CV I %, CV G % Varianza Inter-individuale Sogg 1 Varianza Intra-individuale Sogg Sogg n Mann-Whitney rank sum test (confronto mediane) F-test (confronto varianze intra-individuali) 10

11 ANALISI STATISTICA (II) INDICI DERIVATI: - Differenza critica =,77 [CV A + CV I ] 1/ - Indice di individualità (II) = σ A+I/σ G - n = 3,84*CV A+I /100 (stima punto omeostatico entro ±10%) TRAGUARDI ANALITICI: Se II <0,6: IR non utili Se II >1,4: IR utili IMPRECISIONE: 0,5 CV I (O) 0,5 CV I (D) 0,75 CV I (M) BIAS: < 0,15 (CV I + CV G ) 1/ (O) < 0,5 (CV I + CV G ) 1/ (D) < 0,375 (CV I + CV G ) 1/ (M) ERRORE TOTALE: = 1,65 (0,5 CV I ) + 0,15 (CV I + CV G ) 1/ (O) = 1,65 (0,5 CV I ) + 0,5 (CV I + CV G ) 1/ (D) = 1,65 (0,75 CV I ) + 0,375 (CV I + CV G ) 1/ (M) 11

12 NORMALITA RISULTATI TEST OUTLIER: Cochran s test (duplicati) Cochran s test (σ A+I) Reed s criterion SOGGETTI IDONEI PER LO STUDIO 7 (13 PreM; 14 PostM) 8 (14 PreM; 14 PostM) SHAPIRO-WILK TEST (distribuzione medie individuali) SHAPIRO-WILK TEST (tutti) SI (100%) SI (89%) NO (P <0,001) SI (P=0,16) CONVERSIONE DEI DATI IN log naturali!! Confermato dal Kolmogorov-Smirnov test SHAPIRO-WILK TEST SUI DATI convertiti in log (tutti) SI (P=0,59) Mann-Whitney rank sum test (mediane) F-TEST (varianze intra-individuali) PreM = PostM PreM = PostM PreM = PostM PreM > PostM

13 Premenopausal women Postmenopausal women CA15 (U/mL) Premenopausal women Postmenopausal women HE4 (pmol/l) CA15 (ku/l) HE4 (pmol/l) Mediana, ku/l CV A, % CV I, % CV G, % II DC, % n Mediana, pmol/l CV A, % CV I, % CV G, % II DC, % n Tot 1,3 1,97 9,1 10,6 0,0 5,8 3 Tot 48,6 0,98 9,7 16,4 0,35 PreM 13, 9,1 10,5 0,04 PostM 10,8 9,1 10,8 0,01 PreM 50,6 1,1 15,7 0,59 33, PostM 47,8 6,5 17,4 0,14 18,3

14 RISULTATI TRAGUARDI ANALITICI IMPRECISIONE, % BIAS, % ERRORE TOTALE, % Min Des Ott Min Des Ott Min Des Ott 6,8 4,5,3 5, 3,5 1,7 16,5 11,0 5,5 9,1 6,0 3,0 7,4 5,0,5,4 14,9 7,5 4,9 3, 1,6 7,0 4,7,3 15,1 10,0 5,0 14

15 CONCLUSIONI ALTA INDIVIDUALITA (II<0,6) PER ENTRAMBI I MARCATORI: il monitoraggio dei cambiamenti longitudinali nel tempo delle concentrazioni nel siero è probabilmente una strategia di interpretazione migliore rispetto alla valutazione trasversale del risultato mediante utilizzo di intervalli di riferimento/limiti decisionali Dato che per HE4 la variabilità intraindividuale nelle PreM è doppia rispetto a quella nelle PostM, l interpretazione dei cambiamenti di questo marcatore deve prevedere l impiego di specifiche DC in base alla condizione ormonale della donna 5,8% 33,5% 18,3% 15

16 Centre for Metrological Traceability in Laboratory Medicine (CIRME), University of Milan, IT Mauro Panteghini Clinical Pathology Unit, Luigi Sacco University Hospital, Milan, IT & Chair of Clinical Biochemistry and Clinical Molecular Biology, University of Milan, IT Simona Ferraro, Roberta Mozzi, Doriana Basco Tutti coloro che hanno fornito i campioni di sangue per lo studio Roche Diagnostics per aver fornito gratuitamente i reagenti CA15 ed HE4 per la conduzione dello studio 16

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