Fibrosi Cistica. By NA. Lezione 7

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1 Fibrosi Cistica Lezione 7 1

2 Perche la Fibrosi cistica Per ragioni storiche: e stato uno dei primi geni di cui non si conosceva la funzione clonato e sequenziato perche costituisce un esempio di come si utilizza il linkage e linkage disequilibrium per la mappatura perche e un ottimo esempio per la difficolta della diagnostica 2

3 Cos e la Fibrosi cistica ECCESSIVA PRODUZIONE DI SECREZIONI DENSE. Malassorbimento cronico che comporta incapacita di crescere normalmente(deficit della secrezione degli enzimi pancreatici e quindi insufficiente digestione delle proteine e grassi). Frequenti infezioni del tratto respiratorio da semplici raffreddori a polmoniti (ostruzione delle vie respiratorie minori da parte di un muco denso e loro colonizzazione da parte di batteri). SECREZIONE DI NaCl NEL SUDORE(TEST DIAGNOSTICO) 1 affetto/2500 H-W 1 portatore/25 q 2 = 1/2500 q=1/50 p=1-q=49/50 2pq=2x49/50x1/50= 1/25 LA CF E SOGGETTA AD EFFETTO DEL FONDATORE E AL VANTAGGIO DELL ETEROZIGOTE (e presente in molte popolazioni, ma e piu frequente nella popolazione del Nord-Europa) 3

4 Fibrosi Cistica un po di storia 1985: Analisi di linkage: il gene della fibrosi cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora la localizzazione. Perche il linkage? Perche non si hanno informazioni sulla natura del prodotto del gene: si sa solo che da qualche parte del genoma c e un locus la cui sequenza, quando mutata, provoca la Fibrosi cistica. Si applica il clonaggio posizionale 4

5 Ripuntualizziamo la definizione di gene il gene mendeliano e un entita astratta identificata dalla modalita di segregazione e dalla mappatura in un locus il gene molecolare e una sequenza codificante con una organizzazione definita: 5 UTR, esoni,introni, 3 UTR... corrispondente ad una sequenza amminoacidica o piu genericamente ad un trascritto il locus e una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo: per cui e piu giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus puo essere piu grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus, non fra geni molecolari 5

6 Come fare il linkage Testando tutte le famiglie in cui e presente almeno un affetto con polimorfismi del DNA di cui si conosce la localizzazione. Quando si trova il linkage ho mappato fisicamente il locus Ho trovato il gene?! NO!!! Non ho trovato il gene corrispondente al mio carattere : adesso so dove andarlo a cercare 6

7 Linkage-lod score Il linkage e una relazione di vicinanza fra due loci ed e funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso. Nel caso dell uomo l analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu famiglie. Odds ratio= P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti (1- Θ) n Θ r (1/2) n+r Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage. 7

8 Linkage disequilibrium Il linkage disequilibrium e una situazione per cui un particolare aplotipo e statisticamente piu probabile in un sottogruppo di una popolazione. Indica che la popolazione deriva da un comune ancestore o, nel caso delle mutazioni patogene, che la mutazione e avvenuta su un cromosoma ancestrale comune alla popolazione. Il linkage disequilibrium non ha niente a che fare con la presenza della mutazione patogena e una osservazione che facilita la mappatura genetica. Indica che fisicamente associato al locus A polimorfico c e un altro locus che, quando mutato origina la malattia. Essendo un fenomeno legato all origine comune degli individui della popolazione, in un altra popolazione il disequilibrium riguardera un altro allele del locus A 8

9 Linkage disequilibrium E necessario considerare tutte le cause disequilibrium e solo una delle cause dell associazione: il linkage Causa-effetto e selezione naturale: Un certo allele rende piu suscettibili a manifestare la malattia o permette alle persone malate di sopravvivere e di avere figli Errori per la stratificazione della popolazione o per mancata correzione statistica: se una popolazione e composta di sottoinsiemi geneticamente distinti entrambi i marker possono essere piu frequenti, ma senza che questo implichi un associazione. Nel secondo caso i dati non vengono confermati da studi successivi 9

10 Fibrosi Cistica e linkage disequilibrium Il gene della Fibrosi Cistica e stato clonato grazie alla presenza del linkage disequilibrium. CHR CF (254 con mut) CHR NORMALI (318 wild-type) APLOTIPO ALLELE di ALLELE di numero percentuale numero percentuale XV-2C KM-19 A B C D Incerto 2 4 Dati ottenuti su 114 famiglie britanniche con un figlio affetto. Il cromosoma CF, identificato perche presente nell affetto, tende a portare gli alleli X1 e K2. 10

11 Possibili cause del linkage disequilibrium Potrebbe essere causa dell effetto effetto del fondatore: la mutazione potrebbe essere comparsa in un antenato della popolazione Nord-Europea che portava l aplotipo B e probabilmente gli eventi di ricombinazione non hanno avuto sufficiente tempo per rispristinare una situazione di equilibrio, cioe ad una associazione casuale. Cio significa anche che gli eventi di ricombinazione sono rari tra il gene CF e i due marcatori cioe il locus malattia e e strettamente associato ai due marcatori XV-2C e KM-19 La presenza di un particolare aplotipo potrebbe conferire un vantaggio selettivo nell individuo che lo porta (come accade per gli antigeni HLA: particolari aplotipi sembrano migliorare la risposta immunitaria e percio sono sottoposti a pressione selettiva) La conoscenza del linkage disequilibrium oltre a dare una indicazione della localizzazione precisa del locus malattia, risulta utile per la consulenza: permette di calcolare con maggiore precisione il rischio di trasmissione. Es: normalmente 1/25 portatori nella popolozione nord-europea, ma se un individuo ha aplotipo BB il rischio e maggiore, mentre e molto ridotto per aplotipi AA. 11

12 Clonaggio del gene della CF Tecniche utilizzate Gene walking Chromosome jumping Zoo- blot RICERCA DELLE MUTAZIONI 12

13 CFTR 1989: una volta clonato il gene putativo, bisogno dimostrare che era il gene della fibrosi cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo che il 70% dei cromosomi CF presentavano la delezione di una tripletta (ΔF508) senza che venisse alterata la ORF. Il prodotto del gene e stato definito CFTR( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). OUT IN Nterm ATP ADP+ Pi NBD1 R Domain Cterm NB21 ATP ADP+ Pi 13

14 Conferma del coinvolgimento di CFTR La presenza in omozigosi della ΔF508 in individui gravemente affetti non era conclusiva, anche se molto convincente: la delezione avrebbe potuto essere un polimorfismo come altri in linkage disequilibrium strettissimo con il gene. La identificazione del coinvolgimento di CFTR nel trasporto dello ione cloro attraverso le membrane apicali e la caratterizzazione di alcune mutazioni il cui effetto era piu evidente sull espressione del gene confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi cistica. CFTR cloro 14

15 Diagnosi di CF Oggi sono state descritte oltre 1000 mutazioni nel gene CFTR Molte vengono definite mutazioni private, perche individuate in una sola famiglia. In molti casi non e certo che siano patogene, potrebbero essere sequenze varianti in un cromosoma in cui e presente un allele CF. Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con frequenza che non supera qualche punto percentuale. Sono state trovate mutazioni di diverso genere lungo tutto il gene e probabilmente altre devono essere ancora scoperte La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende molto difficili i test diagnostici per la CF Screening per PCR e successiva ibridazione con oligonucleotidi Amplificazione specifica con primer che legano sequenze mutate 15

16 Tipi di mutazione SONO STATE TROVATE MUTAZIONI DI VARIO GENERE: Mancata produzione della proteina(frameshift e non senso) Mancato processamento della proteina e conseguente ripiegamento anomalo della stessa e incapacita di fuoriuscire nel lume cellulare(δf508) Non corretta regolazione della proteina: il canale ionico e regolato tramite fosforilazione da parte di kinasi camp dipendenti, mutazioni nei domini regolatori della proteina portano al mancato funzionamento di questo sistema. Mutazioni puntiformi che distruggono il canale stesso. Alcuni soggetti presentano mutazioni in omozigosi e sono affetti piu gravemente. Esistono anche casi di eterozigosi composta con mutazioni diverse nello stesso soggetto. 16

17 Ricerca delle mutazione nel gene CFTR Le mutazioni CF sono piu di 800, le piu comuni hanno frequenza diversa nelle popolazioni: ΔF508 va dal 50% nel mediterraneo all 85% in Danimarca e nei paesi baschi, in media il 70% degli ALLELI MUTATI sono ΔF508. Altre 12 mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%. quindi le frequenze medie dei genotipi dei MALATI di fibrosi cistica sono : 49% ΔF508/ΔF508 21% ΔF508/mutaz. comune non ΔF508 21% ΔF508/mutaz.rara 4.5% mutaz. comune non ΔF508/mutaz. rara 2.25% mutaz. comune non ΔF508/ mutaz. comune non ΔF % mutaz. rara/mutaz. rara Circa il 90% degli affetti ha almeno un allele ΔF508 e sara comunque possibile in Europa identificare circa il 70% dei genotipi utilizzando i test per le mutazioni comuni 17

18 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 18