Cara$eris(che stru$urali e funzionali del corpo luteo nella bovina Raffaele Boni

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1 Dipartimento di Scienze, Università della Basilicata, Potenza Cara$eris(che stru$urali e funzionali del corpo luteo nella bovina Raffaele Boni

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4 Modificazioni del calcio intracitoplasma2co (trasduzione del segnale = 2 messaggero) in COC (complessi cumulo- ovocita) immaturi bovini a seguito di s2molazione con FSH o LH (Silvestre, Boni, Fissore, Tos(, MRD 2012)

5 Linee cellulari del CL Size µm % cells % volume Large Luteal cells Small Luteal cells Endothelial cells Fibroblasts Steroidogenic cells (Wiltbank, 1994)

6 Il controllo esercitato dall LH sulla secrezione di P4 sembrerebbe prevalente nella prima fase di sviluppo del CL. TraJando manze con un antagonista del GnRH (LHRH- Ant SB- 75, Cetrorelix) in varie fasi dello sviluppo del CL, Peters et al. (1998) hanno dimostrato una relazione tra livelli in circolo di P4 e trajamento solo nella prima metà dello sviluppo del CL. P * ** TRT CNTRL 2-7d 7-12d 12-17d Peters et al., 1994

7 Rece$ore per LH (LHR) nella bovina LHR 2-3d 5-6d 15-17d Incubando feyne di CL con hcg marcato con Iodio 125. Okuda et al. (1999) Contenuto di LHR mrna Yoshioka et al. (2013)

8 Rece$ore per LH (LHR) nelle cellule del CL nella bovina Livelli rela2vi di LHR mrna Yoshioka et al. (2013)

9 ObiePvi Valutare le variazioni del contenuto di LHR nel corso del ciclo estrale della bovina: 1. In campioni istologici di CL (tecnica Western BloYng) (Ostuni et al., SIRA 2014) 2. In cellule luteiniche ad ayvità steroidogenica (tecnica immunofluorescenza) (Boni et al., SIRA 2015)

10 ANIMALI Ovaia sono state raccolte singolarmente da animali regolarmente macella2 di età pari a mesi (Manze) e > 3 anni (Adulte). Trasportate in borsa frigo al lab entro 3 ore dal prelievo, sono state lavate con PBS e selezionate in base alle carajeris2che morfologiche dei CL/FLs presen2. La classificazione è stata condoja su basi morfologiche come proposto da Ireland et al., I CLs con carajeris2che intermedie, non rientran2 nei parametri normali, o patologici sono sta2 scarta2.

11 Stadio I II III IV V 3-5d 6-9d 10-15d 16-19d >19d

12 Dosaggio LHR nel tessuto luteinico Tecnica Western BloYng

13 In ghiaccio Peso del tessuto 1 h nel buffer di lisi 100 μg 16,500 rcf x 10 min Dosaggio del contenuto proteico mediante metodo Coomassie (Bradford) SDS gel di Poliacrilamide

14 Trasferimento su membrane di nitrocellulosa Blocking solu(on: TPBS + 5% NFDM 1:200 goat an(- hlhr 1:500 mouse an(- αtubuline 1:5000 donkey an(- goat 1:3000 goat an(- mouse An(corpo primario incubazione overnight An(corpo secondario incubazione 1h

15 Pierce ECL Plus WB Substrate KD Membrane scannerizzate con GelDoc- It (UVP). Bande proteiche quan2zzate con ImageJ. Rapporto LHR/α- tubulin analizzato con ANOVA (Systat 11.0) A= tes(colo di topo B= tes(colo di ra$o

16 3d 9d 14d 17d 3d 9d 14d CNTRL LHR Tubuline Western Blot

17 Risulta( WB LHR/αTubuline ra(o A B B B 3-7d 8-10d 13-15d 17-18d A,B (P< 0.01)

18 Peso del CL mg Manze Adulte I II III IV V Stadio del ciclo Volume CL Concentrazione ema(ca P4 Sartori et al. 2004

19 LHR Western Blot Chemioluminescenza relativa P=0.08 Manze Adulte I II III IV V Stadio del ciclo

20 LHR (Western Blot) b a Manze Adulte a,b (P< 0.05)

21 Dosaggio LHR nelle cellule luteiniche Tecnica: immunofluorescenza Valutazione: Microscopio laser confocale Microscopio a fluorescenza

22 Peso del CL Sezionamento del CL Terreno di dissociazione cellule PBS + 0.1% PVA + 2 UI Collagenasi II/ml + 7 UI DNAse/ml + PeniStepto ThermoShaker a 37 C, 1,500 rpm per 90 min Filtrato con filtro di nylon di 50 μm e Diluito con PBS + 20% FCS

23 Centrifuged at 2200 rpm for 15 min Fissate con 2% paraformaldehyde per 60 min Doppio lavaggio PBS Conservazione fino a 3 seymane a 4 C in PBS +0.1%PVA+ Na Azide Doppio lavaggio Blocking solu(on PBS + 5% BSA per 30 min Doppio lavaggio An(corpo primario incubazione 1,5h An(corpo secondario incubazione 1h 1:100 goat an(- hlhr Doppio 1:200 FITC- coniugated lavaggio donkey an(- goat + DAPI LHR LHR LHR

24 Microscopio Laser Confocale Zeiss LSM 510 vs Microscopio a fluorescenza IVOS - Floyd

25 Analisi dei da( Analisi di immagine: ImageJ Misure Cellulari: area, perimetro, Densità integrata, Intensità di fluorescenza rela2va media Analisi Sta(s(ca: ANOVA (Systat 11.0 release)

26 Microscopio Laser Confocale

27 Microscopio a Fluorescenza

28 LHR immunofluorescenza (Microsciopio laser confocale)

29 LHR immunofluorescenza (Microscopio a fluorescenza) Intensità di fluorescenza (a.u.) Manze=2 Adulte=3 I II III IV Gravida Stadio del ciclo

30 Arbitrary Units (fluorescence microscopy) Fluorescence vs Confocal microscopic analysis y = 18,538x + 22,338 R² = 0, Arbitrary Units (confocal microscopy)

31 Non avendo rilevato un nejo limite di discon2nuità tra il diamentro delle piccole e grandi cellule luteiniche, si è fajo riferimento a Wildbank (1994), secondo cui il rapporto tra queste cellule è pari a 88.5 : Arbitrary Units (confocal microscopy) Small cells NS Large Cells Totale cellule esaminate = 467

32 CONCLUSIONI I risulta2 espos2 mostrano un andamento simile nel contenuto di recejore LH nel tessuto luteinico così come nelle cellule luteiniche ad ayvità steroidogenica. L analisi con il microscopio laser confocale permeje di ojenere immagini di migliore qualità. TuJavia, l uilizzo di un più friendly microscopio a fluorescenza potrebbe fornire risulta2 analoghi in termini di esame quan2ta2vo. Altri studi sono in corso allo scopo di carajerizzare le cellule luteiniche e valutare risposte dinamiche a sollecitazioni ormonali. Sia il WB che l immunofluorescenza consentono di ojenere una s2ma della qualità del CL su piccole quan2tà di tessuto, congelato a - 80 C (WB) o fissato dopo dissociazione cellular (IF). Questo potrebbe rendere tali tecniche applicabili in condizioni di campo per l individuzione di patologie luteiniche difficilmente apprezzabili con altre metodiche diagnos2che (es. eco- Doppler).

33 Vi ringrazio per l a$enzione