Laboratorio di Tecniche Microscopiche AA Lezione 12 Marzo 2008 Ore 15-16

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1 Laboratorio di Tecniche Microscopiche AA Lezione 12 Marzo 2008 Ore 15-16

2 L'immunoistochimica e' una tecnica ampiamente utilizzata per l'identificazione e la localizzazione di costituenti cellulari e tissutali in situ. Si avvale della capacità degli anticorpi di legarsi ai loro antigeni in modo altamente specifico

3 Per ottenere anticorpi si parte sempre dall immunizzazione di un dato animale verso l antigene che vogliamo cercare Che tipi di anticorpi troviamo nel siero di un animale immunizzato? ANTIGENE POLICLONALI!!

4 VANTAGGI DI UN ANTISIERO POLICLONALE Inietto questa nel coniglio: Insulina umana L antisiero che ottengo dal coniglio funziona molto bene su pancreas umano o anche di maiale dove l insulina è pressoché identica Insulina umana ma funziona anche abbastanza bene per evidenziare insulina in pancreas di pesce dove l insulina è un po diversa ma abbastanza conservata, specie negli epitopi funzionali Insulina di pesce

5 SVANTAGGI DI UN ANTISIERO POLICLONALE Inietto questa nel coniglio: L antisiero che ottengo dal coniglio funziona bene sui vari pancreas dove l insulina è abbastanza conservata Insulina umana ma se per caso altre proteine hanno almeno un epitopo uguale all insulina, l antisiero lo troverà e alcuni anticorpi vi si attaccheranno Insuline varie Altre proteine qualunque

6 E possibile rendere la reazione molto più specifica producendo anticorpi monoclonali Un animale viene immunizzato contro un antigene. Dalla milza vengono ottenuti linfociti B. Insulina umana Linfociti B dell animale immunizzato

7 Con una procedura complessa viene isolato un solo clone di linfociti B che produce gli anticorpi per un solo epitopo Dal momento che questi linfociti morirebbero rapidamente, vengono immortalizzati fondendoli con cellule tumorali della stessa specie e poi mantenute indefinitamente in coltura per avere una produzione di ANTICORPI MONOCLONALI

8 VANTAGGI DI UN ANTICORPO MONOCLONALE Sarà meno probabile che il nostro anticorpo evidenzi proteine che non c entrano Insulina umana Un policlonale le avrebbe marcate

9 SVANTAGGI DI UN ANTICORPO MONOCLONALE Inietto questa nel coniglio: Insulina umana L antisiero che ottengo dal coniglio funziona molto bene su pancreas umano o anche di maiale dove l insulina è pressoché identica Insulina umana ma potrebbe NON funzionare in pancreas di pesce dove l insulina è un po diversa ma abbastanza conservata, se non considero attentamente quali parti sono conservate e quali no. Insulina di pesce

10 Quando i miei anticorpi, policlonali o monoclonali che siano, si sono legati all eventuale antigene sul vetrino, come faccio a vederli? Coniugo l anticorpo con un altra molecola che posso visualizzare: Fluorocromi Enzimi (fosfatasi alcalina, perossidasi) Devono essere molecole piccole, che non interferiscono con il legame dell anticorpo con il suo antigene

11 Di come posso visualizzare i fluorocromi parleremo la prossima volta Gli enzimi possono essere messi in evidenza fornendo all enzima opportuni substrati per far avvenire una reazione il cui risultato sia la formazione di un precipitato insolubile colorato Quale che sia la molecola scelta per rendere visibile l anticorpo, esistono diversi metodi immunoistochimici:

12 E apparentemente il metodo più semplice, perché è poco usato? METODO DIRETTO

13 METODO INDIRETTO

14 Nel metodo indiretto l anticorpo primario è un anticorpo monoclonale o policlonale diretto contro l antigene di interesse e viene prodotto come visto prima L anticorpo secondario è prodotto in un animale diverso dal primo, il quale viene immunizzato contro gli anticorpi del primo animale Vediamo qualche esempio:

15 Anticorpo ottenuto in pollo anti-coniglio Anticorpo ottenuto in coniglio anti- Na+/K+ATPasi Anticorpo ottenuto in coniglio anti-capra Anticorpo ottenuto in capra anti- Na+/K+ATPasi Na+/K+ATPasi Na+/K+ATPasi Anticorpo ottenuto in capra anti-coniglio Anticorpo ottenuto in coniglio anti- Insulina Anticorpo ottenuto in capra anti-coniglio Anticorpo ottenuto in coniglio anti- VIP Insulina VIP

16 I fluorocromi di cui parleremo in seguito più approfonditamente, hanno un vantaggio sugli enzimi: possono essere osservati uno per volta al microscopio, anche se sullo stesso preparato ce ne sono diversi contemporaneamente Scegliendo opportunamente gli anticorpi e i fluorocromi ad essi coniugati è possibile fare delle marcature multiple sullo stesso preparato

17 Fluorocromo verde Anticorpo ottenuto in coniglio anti- Insulina Anticorpo ottenuto in capra anticoniglio Insulina Anticorpo ottenuto in pollo antitopo Glucagone Fluorocromo rosso Anticorpo ottenuto in topo anti- Glucagone OK, nessun anticorpo dovrebbe dare fastidio agli altri

18 Fluorocromo verde Anticorpo ottenuto in coniglio anti- Insulina Anticorpo ottenuto in capra anticoniglio Insulina Anticorpo ottenuto in coniglio anti-topo Glucagone Fluorocromo rosso Anticorpo ottenuto in topo anti- Glucagone Qua invece l istologo sprovveduto ha commesso un errore quale?

19 Metodi per l amplificazione del segnale: un esempio

20 Quali accorgimenti per ottenere una migliore resa della tecnica? DIMINUZIONE DELLA COLORAZIONE DI SFONDO Eliminazione enzimi endogeni (se usiamo anticorpi coniugati con enzimi) Pre-trattamento del tessuto soluzioni proteiche inerti (come ad esempio la BSA bovine serum albumine) AUMENTO DELLA REATTIVITA Smascheramento degli antigeni eventualmente nascosti dalla fissazione. Smascheramento a calore o enzimatico.

21 CONTROLLI di SPECIFICITA CONTROLLI POSITIVI Utilizzo di vetrini di controllo sicuramente positivi Se nemmeno il vetrino sicuro viene positivo posso cominciare a pensare che: L anticorpo non funziona Sbaglio qualche passaggio Qualcuno dei miei reagenti è inquinato Se non riesco a far venire positivo il vetrino sicuro, il mio dato negativo sul vetrino che mi interessa non ha valore. E nemmeno un eventuale risultato positivo sul vetrino di interesse è tanto convincente. CONTROLLI NEGATIVI Omissione dell anticorpo primario Preadsorbimento dell anticorpo primario con il suo specifico antigene

22 Omissione dell anticorpo primario: cosa può capitare. Caso 1 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo secondario

23 Caso 2 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo secondario

24 Caso 3 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo secondario

25 Preadsorbimento dell anticorpo primario con il suo specifico antigene Caso 1 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo primario preadsorbito e con anticorpo secondario

26 Caso 2 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo primario preadsorbito e con anticorpo secondario

27 Caso 3 Campione trattato con anticorpo primario e secondario Campione trattato con anticorpo primario preadsorbito e con anticorpo secondario

28 ULTERIORI CONTROLLI CON ALTRE TECNICHE Western blot usando lo stesso anticorpo primario Ibridazione in situ per verificare la presenza dell mrna