Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650

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1 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Tesi di Laurea Magistrale in Ingegneria Informatica e dell Automazione Dr. Giulio Spinozzi Relatore: Prof. Paolo Valigi Correlatore: Ing. Fortunato Bianconi Controrelatore: Prof. Gianluca Reali 7 Novembre 2012 Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

2 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Contenuti 1 Introduzione 2 Quantificazione WB 3 Pathway EGFR-IGF1R 4 Validazione del modello 5 Conclusioni e sviluppi futuri 6 Bibliografia Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

3 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Obiettivi della tesi - 1 La Systems Biology è una branca multidisciplinare, basata sulla Systems Theory, che combina strumenti dell ingegneria, della matematica, della fisica e delle biotecnologie per studiare e predire il funzionamento dei sistemi biologici a livello molecolare. Systems Biology Dati quantificazione Esperimenti Modello modellazione Biologia Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

4 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Obiettivi della tesi - 2 Si vuole studiare il comportamento e la reazione della linea cellulare cancerogena H1650, derivata da tumori del polmone, con l ausilio di un modello matematico, ottenuto tramite modellazione (equazioni differenziali) del pathway (via di segnalazione cellulare) EGFR-IGF1R [1]. Il lavoro di tesi (evidenziato in figura precedente) si articola in tre parti: 1 Validazione sperimentale tramite quantificazione dei Western Blot sulle proteine di interesse (EGFR*, IGF1R*, ERK* e Akt*) Dati 3 quantificazione 1 2 Esperimenti 2 Modellazione del pathway per la linea cellulare H Validazione del modello genarale Modello modellazione Biologia Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

5 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Carcinoma del polmone Principale causa di mortalità tumorale Numerosi studi hanno evidenziato: Potenziali bersagli terapeutici per i recettori della famiglia dell EGFR e dell IGF1R L attivazione costitutiva del dominio tirosin-chinasico (MAPK) è in grado di indurre, nella cellula neoplastica, una proliferazione disregolata, favorendone le capacità invasive e metastatiche. Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

6 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Cross talk dei pathways EGFR e IGF1R nelle linee cellulari tumorali del polmone (NSCLC) p90'rsk P'tase EGFR SOS Ras MAPK Raf MEK ERK IGF1R PIK3 Ras/GAP Akt PP2A Fatta la modellazione si vuole: Validare tramite esperimenti su diverse linee cellulari tumorali il comportamento dinamico predetto dal modello nelle condizioni wild type Creare un algoritmo che renda automatica la procedura di quantificazione dei Western Blot sulle linee cellulari TRANSCRIPTION FACTORRS TUMOR CELL SURVIVAL PROLIFERATION AND INVASION Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

7 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Tecniche sperimentali - Western Blot Fino ad ora utilizzato per capire la presenza o meno di una determinata proteina Lo si vuole utilizzare ora per studiare la dinamica di segnalazione cellulare Dispendioso (tempo e denaro) 1 Proteine campione separate su gel in base al peso molecolare 2 Trasferimento su membrana di nitrocellulosa tramite E 3 Sviluppo di precipitato colorato in corrispondenza della proteina Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

8 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Introduzione Sperimentazione - pianificazione Western Blot Serie temporale per ogni singolo esperimento (Akt, EGFR, IGF1R, ERK): Gel 1 t 0 t 1 t 1 t 1 t 1 t 2 t 2 t 2 t 2 t 3 t 3 Gel 2 t 3 t 3 t 4 t 4 t 4 t 4 t 5 t 5 t 5 t 5 t 6 Gel 3 t 6 t 6 t 6 t 7 t 7 t 7 t 7 t 8 t 8 t 8 t 8 dove t 0 rappresenta la proteina all istante iniziale, t 1,...,t 8 dopo 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minuti, in ognuna delle seguenti quattro condizioni: WT: Wild Type L 1 : somministrazione primo ligando, EGFR L 2 : somministrazione secondo ligando, IGF1R L 1 + L 2 : somministrazione di entrambi i ligandi, EGFR ed IGF1R Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

9 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Quantificazione WB I Passi dell algoritmo MATLAB [2] 1 Acquisizione di tutte le immagini di WB 2 Ottimizzazione delle stesse (tramite Image Processing Toolbox) 3 Scarto delle immagini senza informazione 4 Selezione e integrazione dei singoli blot (metodo Otsu) 5 Calcolo dell ottimo tra tutte le esposizioni di β-actina 6 Rapporto di tutte le proteine con l esposizione precedentemente trovata di β-actina Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

10 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Quantificazione WB Ottimizzazione delle immagini Original Optimized Le lastre di WB vengono lavorate 1 Vengono acquisite tutte le immagine del WB 2 Si ottimizzano tramite equalizzazione dell istogramma dell immagine stessa 3 Viene rimosso lo sfondo tramite segmentazione (metodo di Otsu) 4 Vengono scartate le immagini senza informazione Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

11 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Quantificazione WB Selezione ed integrazione dei singoli blot Processo di integrazione e selezione dei blot su immagine ottimizzata: Optimized Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

12 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Quantificazione WB Andamenti delle proteine di interesse, un esempio: Akt* Gli andamenti di EGFR*, IGF1R*, ERK* e Akt*, rapportati alla β-actina: Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

13 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Pathway EGFR-IGF1R Il pathway EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 EGF IGF freeegfr freeigf1r boundegfr boundigf1r SOS PIK3 Ras Ras/GAP P'tase p90'rsk MAPK Raf Akt PTEN Due mutazioni [3]: Sono stati modellati i comportamenti dei due recettori EGFR e IGF1R. Per la dele746-a750 la concentrazione di EGFR* deve essere sovrabbondante E stato inserita l azione di PTEN, che inibisce PIK3; PP2A inibisce Akt* MEK ERK PP2A Integrazione delle equazioni differenziali tramite MATLAB e generazione degli andamenti teorici delle proteine Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

14 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Validazione del modello Validazione del modello per la linea H1650 Vengono confrontati, previo normalizzazione (minimi quadrati), gli andamenti prodotti tramite WB con quelli generati dalle simulazioni. Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

15 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Conclusioni e sviluppi futuri Concludendo Per la prima volta è stato possibile utilizzare il WB per ricostruire la dinamica di segnalazione delle proteine E stato specializzato il modello generale [1] per la linea cellulare H1650 Il modello ottenuto è stato validato con gli andamenti prodotti dall algoritmo di quantificazione del WB Sviluppi futuri 1 Disporre di maggiori istanti temporali nel WB, così da poter ricostruire con maggior precisione gli andamenti temporali 2 Migliorare la tecnica di rimozione dello sfondo, utilizzando tecniche più sofisticate di image processing 3 Estendere il lavoro alle altre linee cellulari a disposizione (A549, H1299, H1975 e H3255) Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

16 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Bibliografia Bibliografia [1] Fortunato Bianconi, Elisa Baldelli, Vienna Ludovini, Lucio Crinò, Antonella Flacco, and Paolo Valigi. Computational model of EGFR and IGF1R pathways in lung cancer: A Systems Biology approach for Translational Oncology. Biotechnology Advances, pages 1 12, June [2] Max Gassmann, Beat Grenacher, Bianca Rohde, and Johannes Vogel. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis, 30(11): , June [3] M L Sos, M Koker, B A Weir, S Heynck, R Rabinovsky, T Zander, J M Seeger, J Weiss, F Fischer, P Frommolt, K Michel, M Peifer, C Mermel, L Girard, M Peyton, A F Gazdar, J D Minna, L A Garraway, H Kashkar, W Pao, M Meyerson, and R K Thomas. PTEN Loss Contributes to Erlotinib Resistance in EGFR-Mutant Lung Cancer by Activation of Akt and EGFR. Cancer Research, 69(8): , April Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

17 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Bibliografia Ottimizzazione delle immagini - DCT Approccio totalmente differente dalla segmentazione 1 Calcolo della Discrete Cosine Transform 2 Offset sui coefficienti superiori al valor medio -> rimozione sfondo 3 Trasformata inversa idct Perdita di informazione Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

18 Modellazione dinamica e strumenti per la valutazione sperimentale del comportamento della via EGFR-IGF1R per la linea cellulare H1650 Bibliografia Il central dogma Principio secondo il quale il flusso dell informazione genetica è mono-direzionale e parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine. Replication DNA Transcription RNA Translation Protein Dr. Giulio Spinozzi Perugia, 7 Novembre / 18

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