Come studiare un genoma complesso. 1. Costruirne la mappa

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1 Come studiare un genoma complesso 1. Costruirne la mappa

2 Costruzione della mappa di un cromosoma Obiettivo: ordinare in modo reciproco lungo il cromosoma geni responsabili di fenotipi riconoscibili, o in generale qualsiasi sequenza di DNA riconoscibile. bello/brutto alto/basso Occhio azzurro/marrone biondo/bruno magro/grasso ricco/squattrinato Risultato

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4 Strategie generali di mappaggio Mappaggio Genetico definizione: l ordinamento di geni sui cromosomi in accordo con la frequenza di ricombinazione il mappaggio genetico può essere utile prima che siano disponibili sonde per il mappaggio fisico Mappaggio Fisico definizione: la determinazione della distanza fisica tra i geni (espressa come coppie di basi del DNA) usando tecniche citogenetiche e molecolari il mappaggio fisico è usato per comporre le sequenze dei genomi complessi.

5 Per la costruzione di una qualsiasi mappa sono necessari dei marcatori (elementi facilmente riconoscibili) Le prime mappe allestite erano basate su criteri genetici; i primi marcatori ad essere utilizzati sono stati geni ai quali fossero associati fenotipi alternativi (alleli). Le mappe basate sui geni non sono tuttavia molto dettagliate (non tutti presentano forme alleliche diverse o facilmente riconoscibili, ed inoltre, nei genomi complessi, i geni sono molto diluiti nel genoma. Marcatori di sequenza, non necessariamente genici, sono chiamati marcatori di DNA. Come per i geni, i marcatori di DNA devono presentare almeno due diverse forme alleliche, devono cioè essere polimorfici. Nel mappaggio fisico i marcatori possono essere le sequenze dei singoli cloni.

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7 Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche: si basano sulla frequenza di ricombinazione fra loci identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo procedere,

8 Per il mappaggio genetico, qualora non si usino fenotipi ma semplici sequenze di DNA, marcatori, queste devono essere polimorfiche RFLP-VNTR-SNP I due alleli 1 e 2 si differenziano per la presenza/assenza di un sito di restrizione nel cromosoma 1/2 1/2 GAGTTC 2/2 1/1 EcoRI EcoRI GAATTC EcoRI EcoRI 150

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13 Tipo di Marcatore RFLP >10 5 Minisatelliti >10 4 Microsatelliti >10 5 SNP >10 5 MARCATORI GENETICI N loci Caratteristiche potenzialmente potenzialmente potenzialmente potenzialmente 2 alleli marcatori, eterozigosi massima 0,5. Southern Blot o PCR. Facile localizzazione fisica Molti alleli altamente informativi. Tipizzazione con Sothern Blot. Facile localizzazione fisica. Tendono a localizzarsi vicino ai telomeri Molti alleli altamente informativi. Si possono tipizzare mediante PCR (multiplex). Facile localizzazione fisica. Distribuiti lungo tutto il genoma Meno informativi. Possono essere tipizzati su ampia scala con appparacchiature automatiche

14 Una volta piazzati i marcatori di DNA sui cromosomi, si può procedere alla costruzione della mappa genetica mediante tecniche che si basano sull associazione genetica. L analisi di associazione si può effettuare in diversi modi: su specie come la drosofila o il topo mediante esperimenti di incroci programmati; nell uomo mediante lo studio dei pedigree.

15 Analisi di linkage mediante RFLP Gli RFLP forniscono marcatori utili per tutti i cromosomi umani i geni malattia ( ) possono essere mappati cercando un linkage tra un polimorfismo, ad esempio un RFLP e il fenotipo malattia Marcatore RFLP A A probe Allele mutato A A allele normale il polimorfismo A/A è in linkage con il gene causa della malattia AA AA A A AA AA A A omozigote eterozigote omozigote

16 Una volta piazzati i marcatori di DNA sui cromosomi, Locus 1 si può procedere alla costruzione della mappa genetica, inserendo geni di interesse, mediante A a l associazione genetica. linkage del gene NF1 (neurofibromatosi) al locus 2 ma non al locus 1; NF1 Locus 2 B C b (wild type) c a A A a A B C B C b c b c b c (sono mostrati solo i cromosomi paterni)

17 Il pedigree mostra l ereditarietà di una malattia genetica, di cui non è noto né il gene né la posizione di mappa. L analisi dimostra che la malattia ha una trasmissione autosomica dominante. Il gene malattia è in linkage con il marcatore, l obiettivo è determinare la fase tra il gene malattia e il microsatellite M, determinando la segregazione degli alleli di quest ultimo (M1-M2-M3...) nei membri della famiglia. Ipotesi X 0 M1 Sano M2 Malato L analisi del pedigree suggerisce l ipotesi 1 come la più probabile e l analisi sulla nonna materna conferma definitivamente l ipotesi.

18 Analisi di Linkage per la neurofibromatosi (NF1) Nf1 nf1 1 2 o Nf1 nf1 2 1 nf1 nf1 2 2 = NF1 nf1 Nf1 1 2 nf1 nf1 1 1 nf1 2 Southern blot nf * L allele rappresentato dalla banda 1 è diagnostico * = ricombinante L allele rappresentato dalla banda 2 è diagnostico

19 Ancora terminologia Aplotipo o fase: l ordine degli alleli di geni diversi sul cromosoma parentale. Se prendo in considerazione 3 loci (A, B e C) ognuno presente in eterozigosi (A1,A2; B1,B2; C1,C2) in un dato soggetto, a priori non posso sapere l ordine sui due cromosomi parentali, che può essere: A1,B1,C1; A2,B2,C2; A1,B1,C2; A2,B2,C1; A1,B2,C1; A2,B1,C2; A1,B2,C2; A2,B1,C1; Nelle popolazioni naturali solo l analisi della progenie mi dice quale era l aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano ulteriormente quando non disponendo di fenotipi codominanti, come i polimorfismi, posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita.

20 Linkage:fase ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE Fase : combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun genitore. Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla ricombinazione. Il locus a (alleli 1, 2, 3 e 4) è in linkage con il locus malattia (M,m) a1 M a1 M a1 M a1 M a1 a1 a1 m M m a1a1 a2a2 a2 m a1a2 a1a2 a1a2 a1a2 a1a2 a3a4 a2 m a2 m a1 a1a2 a1a2 a1a1 a1a4 a2 m M non infor. non infor. infor. infor.

21 Per la maggior parte dei genomi eucariotici la mappa genetica deve essere controllata e complementata da procedure di mappatura alternative. La mappatura fisica dei genomi.

22 Creazione di librerie genomiche Il genoma umano Siti di restrizione potenziali per un dato enzima Digestione parziale

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24 Il clonaggio la ligazione Quale vettore? La trasformazione

25 Selezione dei cloni ricombinanti Crescita clone ricombinante

26 Scelta del vettore VETTORE TAGLIA UTIILIIZZO DELL'INSERTO PLASMIDI 0-10kb Clonaggio e amplificazione di sequenze di DNA Espressione di sequenze geniche procarioti eucarioti FAGI Derivati da λ 20-25kb Costruzione di banche di DNA (LIBRERIE GENOMICHE) Costruzione di banche di mrna (LIBRERIE DI cdna) COSMIDI 30-44kb Costruzione di LIBRERIE GENOMICHE PAC (P1 derived artificial chromosome) kb Costruzione di LIBRERIE GENOMICHE BAC (Bacterial artificial chromosome) Fino a 300kb Costruzione di LIBRERIE GENOMICHE YAC (Yeast artificial chromosome) 0.2-2Mb Costruzione di LIBRERIE GENOMICHE (chimerismo)

27 Yeast Artificial Chromosome (YAC) Permettono il clonaggio di lunghi frammenti di DNA Contengono un centromero, 2 telomeri ed 1 ARS Efficienza di trasformazione bassa Sequenze rip. instabili Chimerismo

28 Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Sito di clonaggio Resistenza antibiotico Origine di replicazione Contengono i geni para e parb che mantengono il numero di copie del fattore F di E.coli a 1-2 per cellula Vengono trasferiti in cellule di coli per elettroporazione Inserti di circa kb Vettori basati su repliconi a basso numero di copie (Fattore F di Coli)

29 Librerie Genomiche Complessità = numero di cloni indipendenti. Può essere definita in termini di Genomi Equivalenti (GE) GE=1 quando il numero dei cloni indipendenti è pari al rapporto dimensioni del genoma / dimensioni medie degli inserti Ad esempio per una libreria di DNA genomico di dimensioni medie di 150Kb, 1 GE = 3000 Mb/150Kb= cloni indipendenti Per ottenere la rappresentatività di tutte le sequenze di un genoma, si cerca di avere librerie corrispondenti a più Genomi Equivalenti (5-10 X)

30 Costruzione della mappa fisica di una regione Obiettivo: ordinare lungo il cromosoma cloni di DNA con inserti che si sovrappongono - CONTIGUI -. Le sequenze dei singoli cloni devono essere riconoscibili.

31 MAPPAGGIO FISICO Sono possibili diversi livelli di caratterizzazione MAPPAGGIO A BASSA RISOLUZIONE (individuazione del cromosoma e della banda citogenetica, distanza tra un clone e il successivo nell ordine delle Mb): Ibridi somatici FISH su cromosomi metafasici MAPPAGGIO AD ALTA RISOLUZIONE (distanza tra un clone e il successivo nell ordine delle kb): Mappaggio di restrizione (risoluzione di alcune centinaia di kb) FISH su fibre di cromatina (risoluzione da 5 a 700 kb) Mappatura mediante STS (sequence tagged site), in cui le posizioni di brevi sequenze sono mappate mediante PCR o per ibridazione di frammenti genomici. SEQUENZIAMENTO (risoluzione 1 bp)

32 Ibridi Somatici Permettono di assegnare i cloni ai singoli cromosomi

33 Metodica Il nucleo con i due assetti cromosomici completi è altamente instabile. Si assiste normalmente alla perdita di cromosomi umani in modo casuale; è possibile favorire il mantenimento di un determinato cromosoma o di un particolare frammento mediante terreno selettivo

34 Disponendo di una batteria di ibridi somatici per tutti i cromosomi umani è possibile mappare una determinata sequenza mediante PCR o Southern-blot, assegnando in questo modo la sequenza ad un determinato cromosoma -> test di concordanza Clone ibrido GeneX Cromosomi umani A B C Svantaggi legati al fatto che le cellule ibride contengono più cromosomi umani Il gene X si trova quindi sul cromosoma 3 Esistono anche ibridi monocromosomici

35 L Ibridazione In Situ con Fluorescenza (FISH) è una tecnica di mappaggio fisico che permette di posizionare i marcatori ibridando una sonda marcata con fluorescenza sui cromosomi intatti, preventivamente fissati su vetrino. L avvenuta ibridazione è visualizzata mediante microscopio a fluorescenza; A seconda della risoluzione voluta i cromosomi possono essere metafasici o interfasici.

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37 FISH ad alta risoluzione Risol. Finalità Vantaggi Svantaggi Cr. metafasici > 1Mb Assegnazione cromosomica Identificazione di regioni omologhe Mappaggio ad una specifica banda Orientamento centel Cr. stirati >200 kb ordinamento Ordinamento centel Nuclei interfasici kb ordinamento Determinazione della distanza Fibre di DNA kb ordinamento Accurata determinazione della distanza Ordinamento difficile No determinnazione distanza Ordinamento cen-tel impossibile Ordinamento cen-tel impossibile FISH su fibre di cromatina = Lisi delle cellule su un vetrino e scivolamento del DNA Se il DNA viene deproteinizzato = Fiber FISH

38 Fingerprint basato sui siti di restrizione Mappaggio fisico ad alta risoluzione basato sul mappe di restrizione di lunghi frammenti di DNA, partendo da DNA genomico o DNA clonato in YAC/BAC/ PAC. Dipende dalla frequenza di taglio dell enzima utilizzato I cloni vengono identificati come overlappanti se almeno 1/3 dei frammenti di restrizione sono in comune

39 Identificazione degli overlapping in base alla somiglianza del pattern di restrizione Facilita il processo di assemblaggio

40 Mappaggio basato sul contenuto di STS (Sequence Tagged Site ) Una STS è una corta sequenza di DNA che è possibile mettere in evidenza con un saggio di PCR. In questo modo si può rapidamente valutare la presenza o l assenza della sequenza in questione in qualsiasi campione di DNA. Le STS non sono necessariamente polimorfiche ma, se lo sono, possono essere utilizzate come marcatori sia per le mappe genetiche sia per quelle fisiche, permettendo di collegarle fra loro. Rappresentano uno strumento molto importante nelle tecniche di mappaggio

41 Gli STS: Sequence Target Site L automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per screenare con la PCR le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui. DNA genomico Clonaggio Sequenziamento STS A,B,C.. B+,D+,G+ H+,F+,T-.. A+,B-,C+.. screening library con PCR A-,B+,C+.. F+,T-,Q+.. scelta dei primers x A,B,C.. A* C B* D G* H F* Q 1 2 mappa fisica:contiguo A C B D G H F Q mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e F-A-G H F Q A C B D G I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi...

42 Come si fa lo screening di una libreria genomica 5X ( cloni) in PCR? cloni in piastre da 99 pozzetti per un totale di 1000 piastre. - Pools primari: pools di 10 piastre (990 cloni) --> 100 PCR Individuazione del pool primario positivo. Trovo un pool di 10 piastre posiivo.

43 - Pools secondari: 1) pools di singole piastre (99 cloni) del pool primario positivo --> 10 PCR. Individuazione della piastra positiva. 2) Pools delle colonne (9 colonne A-I) --> 9 PCR. Individuazione della colonna positiva. 3) Pools delle righe (11 righe 1-11) --> 11 PCR. Individuazione della riga positiva. Quindi, con un totale di 130 PCR, ho individuato il clone positivo su

44 La connessione fra mappe Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Come unirle? la mappa fisica mi dice che un gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati. La mappa genetica me lo permetterebbe perche non riguarda specifiche sequenze, ma anche loci di cui non conosco la sequenza. Non posso pero studiare il gene candidato perche non ho la sequenza corrispondente. La possibilita di generare STS e EST polimorfici ha permesso di risolvere il problema

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46 Dal 1998 al 1999 sono stati sottoposti a fingerprint cloni BAC -15 GE I dati ottenuti sono stati inseriti in database e ordinati in contigui che integrano tutti i dati di mappaggio esistenti in banca dati Clone-by-Clone (Human Genome Project)

47 Il fattore determinante per una molecola di DNA è la sua sequenza nucleotidica. Il Sequenziamento dei Genomi Strategia standard per il sequenziamento di piccoli genomi Clone-by-Clone (Human Genome Project)

48 Ogni clone ( kb) mappato, viene ulteriormente frazionato e sub-clonato in vettore plasmidico Sequenziamento

49 Il metodo a terminazione della catena

50 Il sequenziamento automatico del DNA con dideossinucleotidi marcati per fluorescenza

51 le sequenze dei sub-cloni vengono allineate......fino ad ottenere la sequenza completa del clone genomico da cui derivavano

52 GENOMI COMPLESSI Errori dell analisi dovuti alla presenza di sequenze ripetute

53 Identificazione di sequenze trascritte Identificare all interno di contigui genomici la posizione di geni Il DNA codificante presenta ORF lunghi; Il DNA codificante è conservato nel corso dell evoluzione.

54 1. L analisi degli ORF

55 2. Identificazione di isole CpG Sequenze in genere poste al 5 dei geni Il 56% dei geni associato a isole CpG -> tutti i geni housekeeping più il 40% dei geni ad espressione tessuto specifica Identificazione mediante mappaggio di restrizione Ibridazione su cloni cosmidici Taglio del DNA con ER rare cutter che tagliano in sequenze ricche in GC -> CGGCCG EagI. Ibridazione con clone candidato. La presenza di siti ravvicinati indica la presenza di un isola CpG

56 3. Zoo-blotting Metodo basato sul concetto che le sequenze codificanti sono conservate. Ibridazione in bassa stringenza del clone genomico candidato ad una serie di DNA genomici estratti da varie specie

57 autosomico Xp/Yp

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59 4. Exon trapping L identificazione di un gene si basa sulla capacità del clone di produrre splicing in vitro. Si utilizzano vettori in grado di replicarsi in cellule eucariotiche (Ori e prom SV40)

60 Cellule Cos = hanno integrato un genoma difettivo di SV40 che permette a qualsiasi DNA circolare che contenga a sua volta un origine di replicazione funzionale di SV40 di replicarsi in modo indipendente dal DNA cellulare.

61 Mappe di sequenze trascritte mediante EST Collocazione di sequenze parziali di cloni di cdna su mappe fisiche EST = Expressed Sequence Tags. Sequenziamento a caso dell estremità 3 di cloni di librerie di cdna -> creazione di primer specifici per ogni EST da utilizzare per saggi di PCR su cloni di DNA genomico.

62 Risoluzioni Tipo di mappa Esempi/metodologia Risoluzioni Citogenetica Mappe di restrizione Mappe di contigui di cloni Mappe di STS Mappa di EST Sequenziamento Bandeggio cromosomico e FISH; ibridi somatici Mappe di restrizione con enzimi rare-cutter Overlapping di cloni BAC Sono necessarie informazioni di sequenza per ordinare le STS E necessario sequenziare cloni di cdna e ordinarli su mappe fisiche Parecchie Mb (5-10 Mb) Qualche centinaia di Kb Circa 200 Kb Meno di 1 Kb Circa 90 Kb 1 coppia di basi

63 Clone contig covering whole chr. 21!

64 Clonaggio dei geni patologici Malattia Malattia Posizione di mappa Funzione Posizione di mappa Funzione Gene CLONAGGIO FUNZIONALE Gene CLONAGGIO POSIZIONALE

65 CLONAGGIO FUNZIONALE Schema utilizzato per clonaggio del Fattore VIII il Isolamento del prodotto proteico corrispondente -> sequenziamento amminoacidico -> ricerca delle regioni con minima degenerazione dei codoni -> produzione di combinazioni di oligonucleotidi con tutte le possibili permutazioni -> screening di librerie cdna -> screening di librerie genomiche

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67 sh2/sh2 wild type X Topo shaker-2 (sordo) sh2/sh2 Incroci permettono di mappare sh2 in una regione di 1cM sul cr. 11 murino -> regione sintenica a 17p11.2, candidata per il gene della sordità DFNB3 Isolamento dei cloni BAC murini contenuti nella regione candidata Iniezione del clone in uova sh2/sh2 per produrre topi transgenic Isolamento del gene umano MYO15 BAC 452 corregge il difetto sh2 Mutazioni a carico di MYO15 identificate in 3 pazienti DFNB3 Mappaggio di MYO15 in 17p11.2 Mutazione C674Y identificata nei topi sh2 Sequenziamento del BAC 425 ed analisi computerizzata -> gene myo15

68 POSITIONAL CLONING Genetic disease Map to a chromosome site Retrieve genomic clones that cover the mapped region Identify and analyze exons Isolate a cdna Isolate a genomic clone Characterize the normal gene Mutation detection assays

69 CLONAGGIO POSIZIONALE Identificazione del gene patologico conoscendo solo la localizzazione cromosomica

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71 Presenza di un anomalia citogenetica in un paziente con fenotipo patologico Se l anomalia citogenetica è localizzata all interno di un gene patologico già mappato, questo è un buon indice che l anomalia citogenetica sia causa della malattia Sindromi da geni contigui -> in questo caso il paziente presenta diverse patologie genetiche in contemporanea Presenza di ritardo mentale oltre al fenotipo patologico -> sindrome da geni contigui

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73 Identificazione di geni mediante analisi computerizzata Ricerca di omologie in database di sequenze codificanti mediante l algoritmo BLAST (basal local aligment sequence tool) Geni ortologhi: geni omologhi presenti in organismi diversi; Geni paraloghi: geni omologhi presenti nello stesso organismo, spesso membri di una famiglia multigenica.

74 Identificazione di esoni all interno di una sequenza genomica mediante la ricerca di sequenze conservate tra le giunzioni esoni/introne, siti di biforcazione per lo splicing (Genescan, Grail, Hhmgene, Fex ecc.) Identificazione di geni attraverso l uso di pacchetti di software che utilizzano i programmi presenti nei database per la ricerca di omologie, ed i programmi progettati per individuare motivi associati a geni ed esoni e produrre i risultati in grafico -> NIX (UK Human Genome mapping Product Resouce Center e Genotator (US Lawrence Berkeley National Laboratory)

75 Criteri per l identificazione di un gene malattia Presenza di una mutazione comparazione di individui normali e affetti comparazione di più individui da famiglie normali e affette le mutazioni candidate devono essere trovate solo negli individui affetti Le mutazioni possono distruggere la funzione genica la mutazione individuata deve interferire con il normale flusso dell informazione deve essere possibile distinguere tra polimorfismi e mutazioni queste possono comprendere: grandi delezioni, mutazioni frameshift, mutazioni di splicing, mutazioni nonsenso (stop codon) La funzione genica anomala deve spiegare la patogenesi il gene individuato deve essere normalmente espresso nel tessuto target l espressione è analizzata attraverso: Northern blotting, RT-PCR, per l mrna Western blotting, per l espressione proteica la funzione del gene deve essere consistente con le manifestazioni fisiologiche della malattia (es., CFTR, distrofina)

76 Ulteriori criteri per l identificazione Correlazione genotipo-fenotipo mutazioni diverse correlano con gradi di severità differenti della malattia viene fatta la comparazione tra famiglie diverse La correzione del difetto cura la patologia correzione genotipica: necessità di un protocollo di gene therapy correzione fenotipica

77 Screening delle mutazioni Restaurazione del fenotipo normale per le malattie da loss of function Produzione del modello murino di malattia Problemi legati allo screening delle mutazioni Eterogeneità genetica -> importante la selezione dei pazienti secondo criteri clinici molto rigorosi Omogeneità delle mutazioni Mutazioni difficili da individuare

78 The Human Genome Project

79 Il U.S. Human Genome Project inizia formalmente nel 1990 sotto il coordinamento del U.S. Department of Energy e del National Institutes of Health (NIH).. Gli obiettivi principali del progetto erano: Costruire una mappa completa del genoma umano Immagazzinare i dati ottenuti in banche dati Migliorare gli strumenti per l analisi delle sequenze La sequenza completa del genoma umano e di genomi di organismi modello Trasferire i dati e le tecnologie sviluppate al settore privato Dare una regolamentazione legislativa ed etica La previsione era di terminare il progetto in 15 anni ma lo sviluppo tecnologico ha, di fatto, accelerato le tappe

80 Febbraio 2001

81 Comparison of methods

82 Number of human genes Before genome sequencing After genome sequencing

83 Full Genome Sequences of Model Organisms E. coli e altri procarioti; Saccharomices cerevisiae, utile per le analisi genetiche (alta frequenza di ricombinazione non omologa); Cenorhabditis elegans, utile negli studi dello sviluppo; Drosophila melanogaster; Topo; Primati

84 The Power of Comparative Genomics

85 Mouse - Human overlay Overlay mouse fragments on human scaffolds. Identify genes and conserved regulatory regions Use synteny to aid annotation Use additional data to build mouse scaffolds

86 Comparative Genome Sizes of Humans and Other Organisms Studied Organism Estimated size Estimated number of genes H. Sapiens 3000 million bases 30,000 Drosophila (fruit fly) 180 million bases 13,061 Arabidopsis (plant) 100 million bases 25,000 C. elegans (roundworm) 97 million bases 19,099 S. cerevisiae (yeast) 12.1 million bases 6,034 E. coli (bacteria) 4.67 million bases 3,237! Genome size does not correlate with evolutionary status, nor is the number of genes proportionate with genome size!

87 Ad oggi sono noti circa caratteri di tipo mendeliano, descritti nella Banca Dati OMIM. OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

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