Ruolo della leptina nello sviluppo e nella progressione del carcinoma mammario Proponente Dott. Michele Pellegrino

Transcript

1 Ruolo della leptina nello sviluppo e nella progressione del carcinoma mammario Proponente Dott. Michele Pellegrino I meccanismi di adesione cellulare svolgono un ruolo fondamentale in molteplici processi biologici, quali motilità, crescita, differenziamento e sopravvivenza cellulare (Gumbiner B.M., 1996). Il fenomeno dell adesione cellulare è strettamente dipendente dalla presenza di complessi proteici multimolecolari di recettori transmembranari di adesione, connessi a strutture citoscheletriche intracellulari, nonché a molecole di trasduzione del segnale. Recenti acquisizioni mettono in evidenza come componenti dei complessi di adesione cellulare mostrino interazioni e funzioni multiple, mediando sia i processi di adesione cellulare che i pathways trasduzionali conseguentemente innescati. L adesione cellula-matrice extracellulare e cellula-cellula può sia ricevere che generare informazioni, mediante interazioni molecolari sinergiche e sequenziali regolate dall aggregazione delle cellule, da cambiamenti conformazionali delle proteine coinvolte in tali processi e dal loro stato fosforilativo (Hynes R.O., 1992; Yamada K.M. and Geiger B., 1997). L adesione cellulare consente l aggregazione tra le cellule o tra le cellule e la matrice extracellulare, coinvolgendo numerosi recettori transmembranari che si connettono, attraverso le proteine giunzionali, al citoscheletro. Recenti studi hanno dimostrato come questi legami strutturali transmembranari siano anche coinvolti nella trasduzione dei segnali indotti dall adesione cellulare (Yamada K.M. and Geiger B., 1997). La dinamica e la struttura di tali meccanismi molecolari sono conservate nel fenotipo cellulare normale, o wild type, della maggior parte dei tipi cellulari, mentre nei fenotipi cellulari tumorali si osserva un ampia variabilità di questa organizzazione proteica, nonché dei messaggeri trasduzionali ad essa associati. La trasformazione tumorale, infatti, è caratterizzata da alterazioni dell organizzazione citoscheletrica con conseguente diminuita capacità di adesione e alterata risposta agli stessi processi di adesione. La crescita di molte cellule tumorali è ancoraggio indipendente e spesso tali cellule perdono l inibizione da contatto, tipico meccanismo di regolazione negativa della proliferazione nel fenotipo cellulare normale, innescato da una eccessiva adesione cellula-cellula (Ben-Zeev A., 1997). La leptina, ormone peptidico sintetizzato e secreto principalmente dagli adipociti, la cui produzione è strettamente correlata alla massa adiposa, è capace di aumentare la crescita di numerose linee cellulari tumorali (Bjørbæk C. et al., 1997; Dieudonne M.N. et al., 2002). 1

2 La leptina esplica le sue funzioni biologiche attraverso l interazione con uno specifico recettore di membrana (Ob-R) che mostra un elevata omologia di sequenza con i recettori per le citochine di classe I. Si conoscono diverse isoforme dei recettori della leptina, ma tutti agiscono principalmente attraverso l attivazione delle vie trasduzionali Jak-STAT e MAPKinase (Laud K. et al., 2001). La leptina svolge un importante ruolo sul normale sviluppo della ghiandola mammaria, nonché sul processo tumorogenetico, enfatizzando la correlazione esistente tra obesità ed insorgenza del tumore mammario. Infatti, recenti dati della letteratura hanno evidenziato la presenza di RNA messaggero specifico, della proteina e dei recettori della leptina, non solo in cellule epiteliali mammarie normali, ma anche in linee di tumore mammario (O Brien S.N. et al., 1999). E' stato ampiamente documentato che la leptina è in grado di stimolare la proliferazione di numerose linee cellulari tra cui quelle di carcinoma mammario umano, laddove l ormone amplifica enormemente il segnale estrogenico che sostiene l attività proliferativa cellulare (Wehling M., 1997; Garcia Dos Santos E. et al., 2002; Catalano S. et al., 2003; Catalano S. et al., 2004). Il processo metastatico è conseguenza di un alterato equilibrio tra adesione omofilica (cellulacellula) ed eterofilica (cellula-matrice extracellulare). In particolare, in cellule di carcinoma mammario, l acquisizione di un fenotipo metastatico potrebbe essere correlato ad alterazioni strutturali e funzionali delle giunzioni di adesione intercellulare. Tali giunzioni si organizzano attorno alla proteina transmembranaria E-caderina che, attraverso un gruppo di proteine citoplasmatiche, le catenine (α, β, γ), interagisce con i filamenti di actina citoscheletrica (Bracke M.E. et al., 1993; Sommers C. et al., 1994; Pantel K. et al., 1995; Birchmeier W. et al., 1995). La proteina E-caderina è overespressa in numerose cellule epiteliali mammarie e la sua espressione è generalmente correlata con un fenotipo non metastatico (Sommers C. et al., 1994; Pantel K. et al., 1995; Birchmeier W. et al., 1995). Numerosi studi hanno dimostrato che le E-caderine possono fungere da oncosoppressori; a tal proposito è stato ampiamente documentato come il ripristino delle funzioni delle E-caderine, mediante l overespressione della proteina o in seguito a trattamento con fattori di crescita, sia capace di aumentare l adesione intercellulare riducendo il rischio di formazioni metastatiche (Takeichi M., 1990; Frixen U.H. et al.,1991; Mareel M.M. et al., 1994; Mbalaviele G. et al., 1996; Meiners S. et al., 1998; Mauro L. et al., 2001). Emerge, pertanto, come un aumentata attività di tale proteina di adesione omotipica, influenza la crescita tumorale e ne determina un aumento della massa definitiva, mentre una ridotta espressione ne aumenterebbe le potenzialità metastatiche. Sulla base di tale duplice ruolo funzionale, nel presente progetto di ricerca studieremo i meccanismi molecolari mediati dalla leptina e coinvolti nella crescita cellulare e nella progressione del tumore mammario. 2

3 In particolare, focalizzeremo la nostra attenzione sullo studio di una classe di molecole, le E- caderine, coinvolte nei processi di adesione omotipica connessi ai fenomeni di proliferazione cellulare. A tal proposito valuteremo l azione della leptina sulla modulazione dei segnali di adesione omotipica, E-caderina mediati, in cellule di carcinoma mammario umano MCF-7. In tali cellule sarà valutato il ruolo svolto dalla leptina sull espressione proteica nonché sui livelli di mrna dell E-caderina. Nelle stesse condizioni sperimentali verrà analizzata la localizzazione subcellulare della β-catenina, in quanto effettore a livello nucleare del segnale di adesione omofilico. Inoltre, per meglio riprodurre in vitro le condizioni di crescita delle cellule tumorali in vivo, gli stessi esperimenti saranno condotti mantenendo le cellule MCF-7 sotto forma di aggregati tridimensionali o sferoidi. Ciò permetterà di valutare gli effetti della leptina sulla capacità di aggregazione delle cellule MCF-7 e, mediante studi di Western Blotting e di PCR, sarà possibile valutare l espressione proteica e i livelli dell mrna dell E-caderina in tale modello sperimentale. In una seconda fase di studio, analizzeremo gli effetti della leptina sull attivazione del promotore della E-caderina individuando eventuali sequenze responsive all azione dell ormone. Il coinvolgimento di specifici fattori trascrizionali, capaci di mediare l azione della leptina, sarà successivamente valutato mediante studi di Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP). 3

4 Bibliografia Ben-Zèev A., Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressor. Curr. Opin. Cell Biol. 9: pp Birchmeier W., Hulsken J. and Behrens J., Adherens junction proteins in tumor progression. Cancer Surveys 24: pp Bjørbæk C., Elmiquist J.K., Frantz J.D., Flier J.S., Identification of SOCS-3 as a potential mediator of central leptin resistance. Mol. Cell., Vol. 1, pp Bracke M.E., Vincke B.M., Bruyneel E.A., Vermeulen S.J., De Bruyne G.K., Van Larebeke N.A., Vleminckx K., Van Roy F.M., Mareel M., Insulin-like growth factor receptor and c-src interactions in human breast tumor cells. Mol. Carcinogen 21: pp Catalano S., Marsico S., Giordano C., Mauro L., Rizza P., Panno M.L., Andò S., Leptin enhances, via AP-1, expression of aromatase in MCF-7 cell line. J. Biol. Chem. vol. 278(31): pp Catalano S., Mauro L., Marsico S., Giordano C., Rizza P., Rago V., Montanaro D., Maggiolini M., Panno M.L., Andò S., Leptin Induces, via ERK1/ERK2 Signal, Functional Activation of Estrogen Receptor α in MCF-7 Cells. J. Biol. Chem. Vol. 279(19): pp Dieudonne M.N., Mchinal-Quelin F., Serazin-Leroy V., Leneveu M.C., Pecquery R. and Giudicelli Y., Leptin mediates a proliferative response in human MCF7 breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications Frixen U.H., Beherens J., Sachs M., Eberle G., Voss B., Warda A., Lochner D., Birchmeier W., E- cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells. J. Cell. Biol. 113: pp Garcia Dos Santos E., Dieudonne M. N., Pechquery R., Le Moal V., Giudicelli Y., Lacasa D., Rapid nongenomic E2 effects on p42/44 MAPK, AP-1, and camp response element binding protein in rat withe adipocytes. Endocrinology. 143: Gumbiner B.M., Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell 84:pp Hynes R.O., Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell 69: pp J. Biol.Chem. Vol. 278(31): pp Laud K., Gourdou I., Pessemesse L., Peyrat J.P., Djiane J., Identification of leptin receptors in human breast cancer : functional activity in the T47-D breast cancer cell line. Mol. Cell. End. 188: pp Mareel M., Vleminckx K., Vermeulen S., Yan G., Bracke M., van Roy F., Downregulation in vivo of the invasion-suppressor molecule E-cadherin in experimental and clinical cancer. Princess Takamatsu Symp. 24: pp Mauro L., Bartucci M., Morelli C., Andò S., Surmacz E., IGF-I receptor-induced cell-cell adhesion of MCF-7 breast cancer cells requires the expression of junction protein ZO-1. J. Biol. Chem. 276: pp Mbalaviele G., Dunstan C.R., Sasaki A., Williams P.J., Mundy G.R., Yoneda T., E-cadherin expression in human breast cancer cells suppresses the development of osteolitic bone metastasis in an experimental metastasis model. Cancer Res. 56: pp Meiners S., Brinkmann V., Naundorf H., Birchmeier W., Role of morphogenetic factors in metastasis of mammary carcinoma cells. Oncogene 16: pp O Brien S.N., Welter B.H., Price T.M., Presence of leptin in breast cell lines and breast tumors. Biochem Biophys Res Commun. 259: Pantel K., Schlimok G., Angstwurm M., Passlich B., Izbicki J.R., Johnson J.P. and Riethmuller G., Early metastasis of human solid tumours : expression of cell adhesion molecules. Cell Adhesion and Human Disease, Ciba Foundation Symposium 189: pp Sommers C., Gelmann E.P., Kemler R., Cowin P. and Byers S.W., Alterations in beta-catenin phosphorylation and plakoglobin expression in human breast cancer cells. Cancer Res. 54(13): pp Takeichi M., Cadherins: A molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu Rev. Bichem 59: pp Wehling M., Specific nongenomic actions of steroid hormones. Ann. Rev. Physiol. 56: Yamada K.M., Geiger B., Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: pp

5 Fasi operative Per la realizzazione del presente progetto di ricerca verranno utilizzate cellule di carcinoma mammario umano MCF-7, caratterizzate da un basso potere tumorogenico, esprimenti il recettore estrogenico (ER), il recettore per la leptina (ObR), nonchè la proteina di adesione E-caderina. Mediante studio di time-course (24-96 ore) sarà valutata l attività proliferativa in cellule MCF-7 trattate con leptina e mantenute sia in monolayer che in colture tridimensionali. Al fine di chiarire gli effetti della leptina sul processo di adesione omotipico, valuteremo l espressione dell E-caderina mediante tecnica di Western Blotting in cellule MCF-7 trattate con leptina 1000 ng/ml per 48 ore e mantenute sia in monolayer che in colture tridimensionali. Nelle stesse condizioni sperimentali, mediante RT-PCR, saranno valutati i livelli di mrna di E-caderina, sia in monolayer che in colture tridimensionali. Mediante saggi di trasfezione transiente, utilizzando un plasmide contenente il full lenght del promotore dell E-caderina, saranno studiati gli effetti della leptina sull attivazione del promotore. Lo studio di eventuali sequenze responsive all azione della leptina presenti sul promotore, sarà realizzato trasfettando transientemente diversi costrutti opportunamente deleti. Il coinvolgimento di specifici fattori trascrizionali capaci di mediare l azione della leptina sarà analizzato mediante studi di EMSA e ChIP. Rende Il Direttore Dipartimento di Biologia Cellulare Prof.ssa Giovanna De Benedictis 5