Alcune tecniche di Biologia molecolare ed il loro apporto alle terapie tradizionali

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1 Alcune tecniche di Biologia molecolare ed il loro apporto alle terapie tradizionali Catania, 01 Dicembre 2010

2 è la scienza che, indubbiamente, ha esercitato il maggiore impatto sulla nostra società negli ultimi 30 anni L espansione delle tecniche e dei concetti della biologia molecolare Ha mutato drasticamente influenzato la medicina la farmacologia i fondamenti delle tradizionali scienze umane.

3 ormoni ricombinanti organismi transgenici tessuti creati in vitro alcuni esempi dei prodotti e delle tecniche derivati dalla biologia molecolare diagnosi prenatali xenotrapianti nuovi trattamenti antitumorali l uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) nella scienza forense

4 Non è possibile parlare dell'impatto rivoluzionario delle biotecnologie sulla terapia medica senza ricordare il ruolo che la diagnostica biotecnologica ha giocato nel reimpostare la medicina dell'ultimo decennio. Con il rilancio grazie agli anticorpi monoclonali di tecniche già consolidate come Radio-Immuno Assay (RIA) e Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), la diagnostica è andata assumendo un ruolo di primaria importanza in medicina, già alla fine degli anni settanta. La specificità e la riproducibilità del reagente monoclonale ha permesso, infatti, di raggiungere traguardi di affidabilità e precisione fino a allora inimmaginabili.

5 Verso la metà degli anni ottanta, l uso a scopo predittivo delle nuove tecnologie del DNA ricombinante ha dato vita alla diagnostica molecolare. Sonde costituite dà brevi sequenze di acidi nucleici hanno fatto cosi il loro prepotente ingresso nella determinazione di patologie infettive, neoplastiche e genetiche. Il legame della sonda alla sequenza nucleotidica complementare è altamente specifico ed il ripristino della complementarietà originaria, ovvero la formazione dell'ibrido, avviene solo quando le paia di basi sono esattamente complementari.

6 Ma la rapida diffusione della diagnostica molecolare avviene soprattutto in seguito allo sviluppo Le ricadute della diagnostica biotecnologica sono di grande importanza non solo nel campo della prevenzione, ma anche in quello dello sviluppo delle terapie tradizionali.

7 Le principali metodologie utilizzate per la diagnosi molecolare sono una particolare applicazione di quanto già detto verranno esaminati i vantaggi che i nuovi prodotti biotecnologici offrono alla elaborazione di test diagnostici affidabili e riproducibili. I test diagnostici aiutano a definire una situazione clinica e forniscono informazioni che possono essere utilizzate per decidere la terapia da intraprendere. ELISA Western Blot Alcune tra le più comuni tecniche di biologia molecolare utilizzate in campo diagnostico-molecolare sono Southern Blot Nothern Blot l immunocitochimica PCR (polymerase chain reaction) polimorfismi

8 Cenni ANTICORPI MONOCLONALI Gli anticorpi monoclonali (mab) costituiscono un insieme di anticorpi identici fra di essi in quanto sono prodotti da linee cellulari provenienti da un solo tipo di cellula immunitaria (quindi un clone cellulare). Dato un qualsiasi antigene, è possibile creare uno o più anticorpi monoclonali in grado di legare specificamente un suo determinante antigenico; questo implica la possibilità di individuare, neutralizzare o purificare la sostanza in oggetto. Questa importante caratteristica degli anticorpi monoclonali li rende uno strumento estremamente efficace in biochimica, biologia molecolare, diagnostica e medicina. Quando tali anticorpi vengono utilizzati in campo terapeutico, il nome dell'anticorpo termina con il suffisso -mab.

9 Cenni ANTICORPI MONOCLONALI Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico determinante antigenico (epitopo), è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (monospecifici). Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi. La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose), utili per le loro caratteristiche di maggior crescita e sopravvivenza. Molte delle risultanti cellule ibride (o ibridomi), che vengono coltivate in vitro, manterranno l'immortalità, oltre a produrre grandi quantità dell'anticorpo monospecifico.

10 Cenni ANTICORPI MONOCLONALI La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale immunizzato) e il mieloma di topo (l'animale più usato), viene ottenuta per intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole. Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto con il nome di HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell ibridoma che completa le due linee parenterali. Gli ibridomi vengono sottoposti a screening per la ricerca degli anticorpi specifici cercati e quelli scelti vengono avviati alla conservazione o alla produzione in massa

11 ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) è un tecnica per la quantificazione di proteine che riesce a combinare la specificità di un anticorpo con la sensibilità di un semplice saggio enzimatico, utilizzando anticorpi o antigeni coniugati con enzimi. Il test ELISA, si basa sull'utilizzo di anticorpi marcati con un enzima (generalmente la perossidassi), in modo che i coniugati risultanti abbiano una attività sia immunologica sia enzimatica. Essendo uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra, la reazione antigene-anticorpo è immobilizzata e pertanto potrà facilmente essere evidenziata con l'aggiunta del substrato, che reagendo con l'enzima produrrà una colorazione osservabile a vista o quantificabile con un colorimetro.

12 ELISA Esistono diversi KITS commerciali disponibili e quindi si possono realizzare studi sierologici senza necessità di grandi mezzi. Attualmente il test ELISA è uno dei metodi più utilizzati per la diagnosi sierologica di diverse malattie infettive Il metodo ELISA è una tecnica altamente sensibile e di grande specificità. Questa tecnica presenta, inoltre, una buona riproducibilità e facilità nell'interpretazione dei risultati.

13 ELISA Esistono diversi modelli di tecniche ELISA per la determinazione ANTIGENI ANTICORPI DETERMINAZIONE DI ANTIGENI modello ELISA "Sandwich" La modalità più frequente del metodo ELISA per la determinazione di antigeni è il modello ELISA "Sandwich". In questo modo, la piastra è già predisposta con un anticorpo fissato (monoclonale o policlonale) verso l'antigene campione, al quale si aggiungerà un omogenato dell'organo sospetto, che in caso di reazione con l'anticorpo della piastra, sarà messo in evidenza dopo l'aggiunta del secondo anticorpo marcato con l'enzima. Per ultimo, si aggiunge il substrato per rilevare la reazione.

14 ELISA Saggio diretto o a "sandwich".

15 ELISA Saggio diretto o a "sandwich". Successivamente alle tre fasi si inserisce un liquido che, a contatto con l'enzima perossidasi o con l'enzima fosfatasi alcalina, determina una variazione di colore osservabile al microscopio o, nella maggior parte dei casi, ad occhio nudo. Se non c'è antigene nel campione biologico questo non si lega e allontanato dal lavaggio per cui nemmeno l'anticorpo marcato si lega senza produrre un dettaglio cromografico visibile.

16 ELISA Saggio indiretto A differenza del saggio a "sandwich" nel saggio indiretto si valuta la presenza di un anticorpo specifico all'antigene e il processo può essere anch'esso schematizzato in tre fasi. FASE A. La standardizzazione del saggio avviene agganciando il campione biologico al substrato che può anche qui essere PVC o nitrato di cellulosa. FASE B. Successivamente si inseriscono, in soluzione, un determinato quantitativo di anticorpi monoclonali conosciuti per reagire contro l'antigene specifico di cui vogliamo testare la presenza nel campione biologico. Si procede al lavaggio per eliminare gli eventuali anticorpi che non hanno legato l'antigene. Se l'antigene non è specifico per l'anticorpo allora nessun anticorpo inserito nella fase B potrò legarsi e, con il lavaggio, verra allontanato dal sistema. FASE C. La fase C prevede l'inserimento di un anticorpo marcato in soluzione. La marcatura dell'anticorpo viene effettuata aggiungendo l'enzima perossidasi o fosfatasi alcalina all'anticorpo che è specifico per gli anticorpi inseriti nella fase B. Gli anticorpi della fase C sono chiamati, infatti, anticorpi anti-anticorpi.

17 ELISA Saggio indiretto

18 Campo di utilizzo ELISA VERSATILITÀ DEL SAGGIO ELISA apprezzata nel campo della ricerca nel campo sanitario Nel campo sanitario in particolar modo, è necessario produrre delle diagnosi precise ed economiche. Esistono in commercio numerosi KIT i cui campi di azione si articolano su diversi bersagli antigenici e, anche per questo, l' ELISA è un saggio di prima scelta nei piccoli laboratori e nelle grandi strutture sanitarie. Negli ospedali attrezzati a ricevere donazioni di sangue, difatti, si rende necessario conoscere preventivamente se il paziente è portatore di malattie infettive e grazie alla velocità di esecuzione dell' ELISA queste informazioni possono essere rilevate in poco

19 LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE è un nuovo approccio all esplorazione delle molecole fondamentali alla vita. Il DNA ricombinante è caratterizzato dalla particolare azione di specifici enzimi (Enzimi di Restrizione o endonucleasi) che agiscono sugli acidi nucleici. Le endonucleasi riconoscono sequenze specifiche su DNA a doppia elica che possono essere tagliate. I frammenti che ne derivano si possono separare e individuare per mezzo di elettroforesi su gel. Frammenti contenenti particolari sequenze possono essere identificate attraverso ibridizzazione con una sonda marcata di DNA a singolo filamento (Southern blotting). Il DNA può essere sequenziato per mezzo del taglio chimico al livello di basi particolari (metodo Maxam-Gilbert) o per mezzo dell interruzione controllata della replicazione (metodo di Sanger).

20 LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE I frammenti derivati vengono separati per mezzo di elettroforesi su gel e visualizzati per autoradiografia o per mezzo di marcature fluorescenti. L ibridizzazione con sonde specifiche di DNA complementare (cdna) o di RNA è utile per evidenziare specifiche sequenze. Le sonde di DNA sono utilizzate anche per nuove combinazioni di DNA lunghe un centinaio di nucleotidi, particolarmente importante è la PCR (reazione polimerasica a catena) che rende possibile una grande amplificazione dei segmenti specifici di DNA in vitro. Questa tecnica è molto importante per identificare marcatori patogeni di cellule cancerose, per tipizzare genotipi individuali e per leggere sequenze di DNA da fossili antichi milioni di anni.

21 Enzimi di restrizione e DNA ligasi Sono chiamati anche ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE e sono particolari tipi di enzima che riconoscono sequenze specifiche di DNA a doppia elica tagliando entrambi i filamenti in punti specifici. Caratteristica delle endonucleasi di restrizione è quella di riconoscere sequenze palindromiche di lunghezza compresa tra le quattro e le otto basi idrolizzando un legame fosfodiestere su ciascun filamento di questa regione. Tali enzimi sono usati per tagliare molecole di DNA in frammenti specifici che possono essere analizzati e manipolati. Sebbene le sequenze riconosciute siano alle volte simili, ogni enzima è in grado di discriminarle con estrema precisione. In questa maniera è possibile tagliare l intero genoma umano in frammenti più maneggiabili, detti FRAMMENTI DI RESTRIZIONE; o, conoscendone la sequenza, ritagliarne fuori un certo gene; o ancora, modificare un gene accorciandolo; operazioni queste che preludono a qualunque studio di biologia molecolare.

22 Enzimi di restrizione e DNA ligasi La chiave che ha aperto le porte alla tecnologia del DNA ricombinante è stata l'utilizzazione degli enzimi di restrizione che tagliano il DNA a livello di sequenze specifiche popolazione di molecole eterogenea per lunghezza ma con estremità identiche Prima della scoperta di questi enzimi era molto difficile operare sul DNA, si utilizzava l RNA o le proteine per studiare un determinato sito

23 Riuscendo ad operare con gli enzimi di restrizione e la PCR (processo molto rapido che consente la replicazione in massa del DNA) è stato notevolmente semplificato il processo di analisi della molecola di DNA. Ciò ha permesso una precisa identificazione delle porzioni di DNA che regolano l espressione di un determinato gene Finora sono stati isolati molti enzimi di restrizione da diverse specie di batteri. Ogni enzima taglia il DNA a livello di una precisa sequenza nucleotidica La specificità e la varietà degli enzimi di restrizione hanno permesso ai genetisti molecolari di identificare e isolare segmenti del DNA di molti organismi, compreso l uomo

24 Ci sono numerosi enzimi di restrizione in 861 tipi di batteri diversi, dal punto di vista biochimico sono delle endo-desossi-ribonucleasi di origine batterica che scindono un legame fosfodiesterico QUESTI ENZIMI Il DNA endogeno viene metilato (o modificato) sui residui di adenina e citosina.

25 Gli enzimi di restrizione si possono suddividere in varie classi: per specificità e sito di legame per struttura proteica per dipendenza da cofattori CLASSE 1: Sono complessi enzimatici multifunzionali che richiedono adenosin-metionina e Mg++, in quanto senza la presenza di tali ioni l enzima non funziona. Questi enzimi tagliano in siti aspecifici a valle di circa paia di basi rispetto al punto che identificano come sito specifico CLASSE 2: Gli enzimi di questa classe vengono anche detti sito-specifici poiché idrolizzano in prossimità del sito di legame. Infatti a differenza degli enzimi della classe 1, tagliano esattamente il DNA nel sito riconosciuto. Anche questi complessi enzimatici necessitano degli ioni Mg++ CLASSE 3: Sono complessi multienzimatici che tagliano in direzione 3 a paia di basi di distanza a valle del sito riconosciuto. E necessaria anche in questa classe la presenza degli ioni Mg++

26 La seconda classe è la più interessante Sequenze palindromiche (4-8) che presentano la stessa sequenza se lette in direzione 5-3 Tutti gli enzimi di restrizione operano attraverso due processi di taglio dando luogo a due tipi diversi di estremità Sticky end Blant-end Le estremità di tipo Stickers possono formare legami idrogeno con sequenze di basi complementari quindi coesive e sono utilizzate per unire segmenti di codice genetico idrolizzato con lo stesso enzima Questa "adesività" permette di unire insieme frammenti di DNA non omologhi inoltre, è possibile unire DNA provenienti da organismi diversi al fine di studiarli meglio

27 STICKY END

28 BLANT-END Le estremità della tipologia Blant-end risultano invece piatte e quindi sono utilizzate per unire due siti di DNA idrolizzati con due enzimi diversi Tuttavia, molti enzimi di restrizione generano frammenti con estremità tronche non adesive In condizioni appropriate un particolare tipo di DNA-ligasi (l enzima che "incolla" le estremità) può congiungere dei frammenti che hanno questo tipo di estremità

29 L'ASSE DI SIMMETRIA NELLE SEQUENZE DI DNA La maggior parte degli enzimi di restrizione si lega a sequenze specifiche didna (siti di restrizione) che sono simmetrici attorno al loro punto mediano. La figura mostra il sito di restrizione per l'enzima EcoRI sul DNA. L'asse di simmetria non implica che quello sia il punto in cui l'enzima taglia l'asse. Siti di taglio di restrizione EcoRI PstI SmaI

30 Finora sono state caratterizzate oltre 2000 endonucleasi di restrizione differenti, che vengono identificate con una sigla di tre lettere: la prima, maiuscola, è la lettera iniziale del nome del Genere, e le altre due, minuscole, sono le prime due lettere della stessa specie batterica. Ad esempio, EcoR1 e HindIII sono endonucleasi di restrizione presenti rispettivamente in particolari ceppi di E. coli e di Haemophilus influenzae.

31 esistono particolari condizioni che possono influire negativamente sull attività enzimatica che dipendono dà: 1. PUREZZA DEL DNA ESTRATTO: un DNA impuro può alterare l azione dell enzima. 2. TAMPONE: il tampone viene venduto insieme all enzima specifico. Se si devono utilizzare diversi tipi di enzimi la concentrazione salina del tampone deve essere compensata in maniera adeguata. 3. TEMPERATURA; l enzima non deve essere sottoposto a sbalzi di temperatura. 4. METILAZIONE DEL DNA: se il DNA è metilato l enzima non riconosce il sito. 5. NUMERO DI PROTEINE LEGATE: se il DNA è avvolto in istoni l enzima non riconosce il sito. 6. VISCOSITA DEL DNA 7. GLICEROLO: l enzima per non rovinarsi è venduto in soluzione di glicerolo cosicché anche alla temperatura di 20 C non viene congelato. Possono nascere dei problemi quando la concentrazione di glicerolo supera il 5% poiché l enzima viene inibito. 8. PH ED ETANOLO: sono altri due componenti che possono inibire l enzima alterando il risultato dell esperimento. 9. PUNTALI NUOVI: bisogna utilizzare puntali sempre sterili onde evitare la contaminazione delle soluzioni. L unità di misura dell enzima è 1U, che è la quantità di enzima che taglia in un ora a 37 C 1 microgrammi di DNA campione

32 Cenni sulle sonde di ibridazione Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata ed avente una sequenza complementare al DNA bersaglio che vogliamo individuare. Poiché la sonda e il DNA bersaglio sono complementari, possono appaiarsi ed ibridare. Naturalmente sia il DNA blottato su filtro, che il DNA sonda devono essere denaturati a filamenti singoli. Le condizioni di ibridizzazione prevedono condizioni severe - alte temperature (65 C) e alta forza ionica, che permettono ibrididazioni solo tra molecole omologhe. La posizione del frammento di restrizione bersaglio sulla membrana è quindi identificata grazie al segnale del marcatore associato alla

33 Cenni sulle sonde di ibridazione Per effettuare l ibridazione, la membrana viene messa, in genere, in un contenitore di vetro con la sonda marcata e una soluzione tampone; il contenitore viene fatto ruotare delicatamente per parecchie ore, in modo da permettere alla sonda di ibridare con il DNA bersaglio. La membrana viene poi lavata per rimuovere la sonda in eccesso e il segnale della sonda viene identificato.

34 SOUTHERN BLOT Nella tecnica del Southern blot, così chiamata in onore del suo ideatore E.M. Southern, gli ENZIMI DI RESTRIZIONE, permettono di dividere il DNA in maniera riproducibile: su ciò si basa la possibilità di isolare il frammento di interesse, cioè quello che contiene una specifica sequenza, che si realizza attraverso il Southern blot. I frammenti di restrizione di un campione (quelli che si ottengono dopo l incubazione del DNA con un enzima di restrizione) sono separati per mezzo dell elettroforesi; quindi il DNA viene denaturato e trasferito dal gel a un substrato solido ( in genere un filtro di nitrocellulosa), in modo tale da mantenere la

35 SOUTHERN BLOT Il filtro viene successivamente messo a contatto con una sonda specifica marcata radioattivamente. La sonda si lega al filamento complementare e l autoradiografia rivela quindi la posizione dell insieme ibridato (cioè del complesso frammento di restrizione-sonda). I frammenti che ibridizzano con la sonda possono essere facilmente rilevati dalla autoradiografia. In questo modo si può identificare un frammento particolare in mezzo a milioni di altri frammenti. La stessa procedura di analisi può essere seguita per individuare specifiche sequenze di RNA. La tecnica di analisi dell RNA è stata chiamata Northern blotting.

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37 Northern blotting La tecnica del Northern blotting è del tutto analoga a quella precedentente descritta del Southern blotting, a parte la notevole differenza che si utilizza per identificare RNA. Dal punto di vista tecnico i Northern blots sono più difficili per la considerevole propensione dell RNA a degradarsi. Per evitarlo bisogna osservare molte precauzioni, lavorare in ambienti ragionevolmente privi di RNasi ed utilizzare inibitori delle RNasi (Rnasine, DEPC, ecc.) Contrariamente a quello che si potrebbe credere anche gli RNA vanno denaturati per liberarli da strutture secondarie molto stabili. A questo scopo gli RNA vengono fatti correre su gels di agarosio denaturanti ( per es. urea, formaldeide o gliossale) Oltre al classico blotting per capillarità, per i Northern blotting si usano degli apparecchi commerciali che trasferiscono l RNA per aspirazione sotto vuoto in tampone alcalino.

38 RNA totale elettroforesi denaturante Esempio di Northern blotting pesi ibridazione con sonda radioattiva trasferimento alcalino su membrana carta da filtro membrana gel tampone di trasferimento autoradiografia

39 Western blotting La variante proteica del Southern blot prende il nome di Western blotting. A differenza delle tecniche usate per gli acidi nucleici, nel Western blotting non si usa mai il trasferimento per capillarità ma l elettroblotting. A differenza degli acidi nucleici, le proteine non hanno carica unitaria ma presentano una enorme eterogeneità di carica. Questo problema viene generalmente risolto separando le molecole proteiche in gel di acrilamide su SDS.

40 Western blotting In questo modo oltre a sfruttare la grande capacità di risoluzione dell acrilamide, l SDS, in congiunzione alla temperatura e ad agenti riducenti, denaturano tutte le sub-unità proteiche in complessi micellari SDS-proteine che conferiscono loro carica e massa approssimativamente unitaria. In questo modo le proteine migreranno tutte, come gli acidi nucleici, verso il polo positivo con velocità inversamente proporzionale al log 10 del peso molecolare. A differenza di altre tecniche di ibridazione il western blotting non fa ricorso a sonde di acidi nucleici ma ad anticorpi diretti contro la/e proteina/e in analisi. L anticorpo primario viene quindi riconosciuto da un anticorpo secondario al quale viene coniugato un cromoforo, di solito di natura enzimatica, che ne permette la rivelazione.

41 WESTERN BLOT La tecnica del Western blot è una estensione dell elettroforesi su gel di poliacrilammide, con cui si separano le molecole proteiche presenti in un campione in base al loro PM. È un tecnica che permette l analisi sia qualitativa che quantitativa delle proteine presenti in un estratto cellulare, basandosi sul riconoscimento di anticorpi specifici diretti contro un dominio o una sequenza segnale (tag) inserita nella proteina. Si procede preparando un estratto proteico dalle cellule. Da questa miscela viene separata la proteina di interesse tramite elettroforesi in gel SDS-PAGE.

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43 WESTERN BLOT Separazione di Proteine I campioni contenenti le proteine sono miscelati con il tampone di carico (loading buffer) e caricate sull SDS-PAGE gel Le proteine attraverso l elettroforesi sono separate a seconda della loro dimensione Western Blot Transfer Le proteine separate sono trasferite dal gel su una membrana (nitrocellulosa) con l elettro-blotting

44 Western blotting 1. Gel di poliacrilamide in SDS 3. Elettroblotting V 0,2A + Gel Spugna Spugna Membrana 2. Preparazione del sandwich

45 WESTERN BLOT Western Blot Detection Dopo il trasferimento, I siti non specifici vengono bloccati con un tampone (Blocking) che contiene proteine (BSA, milk, Detector Block). L incubazione degli anticorpi primario e secondario/coniugato seguono il blocco. Dopo il lavaggio della membrana, il coniugato viene riconosciuto aggiungendo il substrato cromogenico e chemiluminescente Western Blot Risultati... Le bande indicano la dimensione e la presenza di specifiche proteine (linea per linea), La dimensione è determinata dalla comparazione di standard di peso molecolare. PM (kda) A B

46 PCR Un importante passo in avanti della biologia molecolare messa a punto di una tecnica nota come PCR ovvero reazione a catena della polimerasi. permette la riproduzione in numerosissime copie di un frammento specifico di DNA, in tempi più rapidi (la reazione ha andamento esponenziale) e in modo più semplice di quanto si riesce a fare con la clonazione PCR sfrutta alcune peculiarità della duplicazione del DNA ad opera della DNA polimerasi Le prestazioni (maggiore resa, minor tempo, minori costi) sono migliorate con l avvento delle DNA polimerasi termostabili (Taq DNA polimerasi), isolate da batteri termofili, che hanno sostituito la DNA polimerasi di E. coli Può essere effettuata su DNA genomico o cdna (DNA copia, retrotrascritto da RNA)

47 PCR LA DNA POLIMERASI, lega in sequenza, diversi nucleotidi in modo da creare un filamento di DNA, usando come stampo un altro singolo filamento dello stesso acido nucleico 1. Necessità di avere un DNAss (riscaldamento) come stampo per la sintesi di un filamento complementare 2. Necessità di possedere un piccolo DNA innesco (primer) per iniziare la sintesi, in corrispondenza del frammento che si vuole amplificare 3. Sintesi del DNA solo in direzione Al termine di n cicli, il miscuglio di reazione contiene un numero massimo teorico di molecole di DNA a doppia elica pari a 2n

48 Composizione tipica di una reazione di PCR: DNA contenente la sequenza da amplificare Due primers DNA polimerasi Miscela dei quattro nucleotidi precursori (dntps: 2 desossinucleosidi 5 trifosfato) Riscaldamento 94 C, 5 min STEP 1 Separazione filamenti Raffreddamento C, 30 s Appaiamento primers (Annealing)

49 STEP 2 STEP 3 Sintesi DNA 72, 5 min Appaiamento primers (Annealing) Riscaldamento 94 C, 20 s Sintesi DNA 72 C, 5 min Separazione filamenti Filamenti originari Raffreddamento C, 30 s Filamenti estesi all estremo 3

50 Ad ogni ciclo il numero dei frammenti desiderati (quelli cioè posti tra i due primers) si raddoppia (crescita esponenziale) 72 C, per 10 min

51 Vantaggi dell uso della Taq polimerasi 1. L enzima può essere aggiunto una sola volta all inizio della reazione e rimane attivo per cicli di PCR. 2. E così possibile automatizzare la PCR utilizzando apparecchi termostatici ciclici. 3. La Taq polimerasi aumenta la specificità e la sensibilità della PCR. Per verificare il buon andamento dell amplificazione, in genere vengono effettuate delle elettroforesi in gel di agarosio

52 ELETTROFORESI ED ANALISI DEI CAMPIONI DI DNA OMOZIGOTE DOMINANTE se c'è una banda sola che corrisponde al controllo (+/+), la persona è omozigote (+/+) OMOZIGOTE RECESSIVO se c'è una banda sola che corrisponde al controllo (-/-) la persona è omozigote ETEROZIGOTE se ci sono due bande che corrispondono al controllo (+/-) la persona è eterozigote (+/-) BANDA ASSENTE: NON ESISTE LA SEQUENZA COMPLEMENTARE AI PRIMER (il DNA non viene amplificato)

53 In base alla disposizione delle bande è possibile individuare il genotipo di un individuo

54 FATTORI CHE INFLUENZANO UNA PCR Scelta dei primers SPECIFICITA Condizioni di reazione Contaminazioni Eterogeneità SENSIBILITA Presenza di inibitori Efficienza della reazione Standardizzazione della preparazione del campione RIPRODUCIBILITA Standardizzazione del protocollo di PCR Standardizzazione del metodo di rivelazione

55 ALCUNI UTILIZZI DELLA PCR A SCOPO DIAGNOSTICO In medicina la PCR può offrire importanti informazioni diagnostiche, usando primers specifici si può identificare la presenza di virus o di batteri Si possono identificare mutazioni a carico di alcuni geni per il controllo della crescita cellulare, può essere utilizzata inoltre per stabilire discendenze biologiche. L analisi di sangue e di campioni di spermatozoi attraverso la PCR può fornire informazioni anche in casi di aggressioni e violenze carnali, inoltre tali metodica permette di ricostruire il DNA da campioni antichi amplificandone i rari frammenti sopravvissuti.

56 ALCUNI UTILIZZI DELLA PCR A SCOPO DIAGNOSTICO Diagnosi di Tubercolosi mediante PCR si estrae il DNA da una lesione e lo si amplifica con primers specifici per un gene altamente conservato in tutte le specie di Mycobacterium tubercolosis. Qualora c è amplificazione, il frammento viene ibridizzato con delle sonde specie-specifiche in modo da identificare il ceppo in questione. Diagnosi HIV mediante PCR si utilizzano primers specifici per il DNA virale. Se c è amplificazione il soggetto è infettato da HIV Diagnosi prenatale di emofilia effettuata mediante PCR : nel gene mutato viene perso il sito di BclI per cui l azione dell enzima di restrizione non produce due frammenti (99 e 43 bp) ma rimane il frammento integro (142 bp). Determinazione del sesso Per le malattie ereditarie legate all X che colpiscono solo i maschi. Es. nel cromosoma Y sono presenti delle sequenze uniche (DYZ1 di 3,5 kb ripetuta 5000 volte) che possono essere amplificate mediante PCR

57 IN CONCLUSIONE

58 Di recente si è ipotizzato che la variabilità del virus sia alla base dell'ancora misteriosa progressione dell'aids. Anche la diagnosi prenatale delle malattie genetiche giocherà un ruolo fondamentale nella medicina del secolo futuro.

59 Le prospettive per i prossimi anni sono veramente entusiasmanti, ma parecchi problemi devono essere ancora risolti. Molte delle mutazioni responsabili per le malattie genetiche sono veramente infinitesime rispetto all'effetto drammatico che esse possono avere a livello fenotipico: anche il cambio di una sola base in un gene può essere sufficiente per eliminare l'espressione della proteina codificata da quel gene. D'altra parte la variabilità a livello genetico tra individui diversi è un fatto comune, cosi come cambiamenti a livello genico possono avvenire senza influenza sull'espressione delle proteine. La sfida della diagnostica molecolare è dunque duplice trovare la mutazione rara nella sequenza genica distinguere le mutazioni importanti dal normale polimorfismo

60 A livello di laboratorio di ricerca l abbinamento di diverse tecniche di biologia molecolare rende anche possibile l'identificazione di piccoli difetti genici dovuti a delezioni o inserzioni di una o di poche basi, ma il trasferimento a livello di test clinico o di screening di popolazioni è ancora problematico e richiede ulteriori sviluppi della tecnologia. Concludendo, quindi, non vi sono dubbi nell'affermare che le biotecnologie stanno cambiando radicalmente il modo in cui l uomo combatte là malattia, cosi come è altrettanto chiaro il fatto che i tempi con cui si acquisiscono nuove conoscenze di importanza rivoluzionaria vadano sempre più accorciandosi grazie a tecnologie fino a pochi anni fa inimmaginabili.

61 grazie per l attenzione..

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63 SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il sequenziamento del DNA è la tecnica elettiva per determinare la successione di basi (sequenza) di un gene o di più tratti genici (fino all intero genoma). Le tappe prevedono: denaturazione del DNA ibridazione di un innesco (20 bp) allungamento dell innesco ad opera della DNA polimerasi (frammento di Klenow) terminazione della catena con 1 dideossinucleotide (ddatp, ddttp, ddgtp, ddctp)

64 SEQUENZIAMENTO DEL DNA (SANGER) 3 2

65 SEQUENZIAMENTO DEL DNA (MAXAM-GILBERT)

66 SEQUENZIAMENTO DEL DNA (SANGER)

67 SEQUENZIAMENTO DEL DNA (SANGER)

68 APPARECCHIATURE PER SEQUENZIAMENTO CROMATOGRAMMA DI UNA SEQUENZA