Crioconservazione di gemme di portinnesto Kober 5BB (Vitis berlandieri x Vitis riparia): aspetti anatomici

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1 Italus Hortus 14 (3), 2007: Crioconservazione di gemme di portinnesto Kober 5BB (Vitis berlandieri x Vitis riparia): aspetti anatomici Fabbri A. 1*, Ganino T. 1, Lombardi M. 2 e Nisi R. 1 1 Dipartimento di Biologia Evolutiva e Funzionale Sez. Biologia Vegetale, Università di Parma, Parco Area delle Scienze 11/a, Parma 2 CNR Istituto per la Valorizzazione del Legno e delle Specie Arboree, via Madonna del Piano, Sesto Fiorentino (FI) Cryopreservation of shoot tips of Kober 5BB rootstock (Vitis berlandieri x Vitis riparia): anatomic studies Abstract. Micropropagated buds of the grape rootstock Kober 5BB were cryopreserved with the vitrification technique. The procedure involved the use of cryprotectant substances, dehydration by vitrifying solution, quick freezing in liquid nitrogen, and finally regeneration. The critical points of the procedure were the time of contact of explants with PVS2, which can result toxic on explants if they are exposed to it for too long time, and sucrose concentration in preculture media (hardening). Histological analyses were carried out to evaluate any modifications determined by treatments and to locate the damage within the bud. PAS-Amido Black staining showed that with the increasing of contact time with the vitrifying solution bud peripheral cells appear degenerated following plasmolysis; however, the meristematic tip remains vital after undergoing cryopreservation. The problem of lack of regeneration after liquid nitrogen seems instead to be due to the isolation of the meristematic zone, which ends up encapsulated in a thick layer of degenerated cells. Key words: ex situ conservation, vitrification, gelification, starch, dehydration. Introduzione La vite è una delle più importanti colture arboree. Il germoplasma di vite è dunque un importante risorsa genetica e la sua conservazione è indispensabile soprattutto se si pensa al miglioramento genetico e ai benefici che da esso possono derivare. La tecnica classica di conservazione del germoplasma di vite è la costituzione di campi collezione (conservazione in situ), ma questa presenta due problemi fondamentali, * andrea.fabbri@unipr.it l ampio spazio richiesto per la costituzione e gli alti costi di mantenimento (Lambardi et al., 2000). La conservazione del germoplasma ex situ rappresenta una valida alternativa all in situ. L ex situ include l uso delle tecniche di conservazione a crescita lenta (Galzy e Compan, 1988; Benelli et al., 2002) e la crioconservazione di cloni in vitro (Plessis et al., 1993; Zhao et al., 2001). Generalmente il processo di rigenerazione degli espianti crioconservati è rapido anche se alcuni autori hanno riportato formazioni di callo e sviluppo anormale dei germogli (Gonzales- Benito e Perez, 1994; Towill, 1990). La tecnologia criogenica, con la conservazione di organi e tessuti vegetali in azoto liquido (-196 C), offre importanti prospettive per la salvaguardia della biodiversità e il mantenimento a lungo termine di specie arboree (Lambardi e De Carlo, 2003). In questo studio sono stati analizzati aspetti anatomici che influenzano la conservazione di gemme ascellari del portinnesto Kober 5BB, applicando la tecnica di crioconservazione, mediante l utilizzo della soluzione vitrificante PVS2 (Plant Vitrification Solution 2). L osservazione delle modificazioni istochimiche che si producono, durante il trattamento con le soluzioni vetrificanti (fase di indurimento dell espianto), potrebbe consentire di meglio comprendere l andamento del processo di disidratazione e di individuare i punti critici di tale processo. In tal modo potrebbe risultare possibile l individuazione delle cause della scarsa rigenerazione dopo trattamento criogenico, e quindi il miglioramento della procedura. Materiali e metodi Nel presente studio sono stati utilizzati espianti di Kober 5BB (gemme), portinnesto di vite americana. Le piante madri sono state propagate in vitro su substrato contenente sali MS (Murashige e Skoog, 1962), 3% saccarosio, 0,8% agar, 5 µm ormone di crescita BA (benziladenina), e fatte crescere in cella climatica a temperatura di 25 C con fotoperiodo di 16 ore. Dalle plantule di dimensione di 10 cm, derivate da 82

2 Biodiversità e vivaismo subcultura, sono state prelevate gemme ascellari per sottoporle a crioconservazione mediante tecnica di vitrificazione (Matsumoto et al., 2000). Durante il processo è stata valutata la concentrazione di saccarosio nel terreno di precoltura (0,2M, 0,3M e 0,4M) e il tempo di contatto con il PVS2 (30, 60 e 90 ). Dalla combinazione delle due variabili sono stati studiati 9 protocolli di crioconservazione. Per ogni protocollo e per ogni punto critico dello stesso (precoltura, dopo trattamento con CP, dopo contatto con il PVS2 e dopo immersione in azoto liquido), è stato previsto il prelievo di gemme (almeno 3 per ogni tesi). Dopo la fissazione del materiale vegetale in FAA, si è provveduto alla disidratazione e inclusione in resina (Technovit 7100) e al successivo taglio longitudinale (3 mm) mediante microtomo semifine Leitz 1512 dotato di lama monouso Histoknife H. Le sezioni sono state trattate con PAS- Amido Black (Ruzin, 1999), analizzate mediante software di analisi d immagine Leica QWin V3 (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd, Cambridge, UK) e i dati sono stati analizzati statisticamente mediante ANOVA multivariata e test di Tukey (p = 0,05) utilizzando il software SPSS 13.0 (SPSS Inc. Headquarters, Chicago, Illinois). Risultati e discussione Gli espianti in studio sono gemme di dimensione variabile (area della sezione longitudinale sagittale da mm 2 a mm 2 ), costituite da meristema apicale, zona subapicale e i primi 2 primordi fogliari. La zona meristematica è costituita da 2-4 strati di cellule, le quali mostrano un denso citoplasma e vacuoli di piccole dimensioni o assenti. Le cellule della zona periferica o subapicale contengono vacuoli di dimensioni crescenti all allontanarsi dalla zona meristematica. In condizioni normali, non sono mai presenti granuli di amido (fig. 1). Durante il processo di crioconservazione sono stati identificati due punti critici fondamentali per la buona riuscita della metodica: disidratazione ed effetto tossico del PVS2. La disidratazione osservata nelle tesi in studio appare, inizialmente, come distacco del citoplasma dalla parete cellulare, e quando si procede con il protocollo di crioconservazione il fenomeno si intensifica: all interno delle cellule il citoplasma è ben visibile, le cellule non hanno più turgidità e appaiono di forma irregolare (fig. 2). L effetto della disidratazione si manifesta già durante la precoltura, ma solo quando la concentrazione del saccarosio nel mezzo è nei valori più alti. Infatti a 0,3 e 0,4M di saccarosio le cellule differenziate appaiono leggermente disidratate e i primi fenomeni di plasmolisi si manifestano, nei parenchimi delle gemme, dopo trattamento con CP. Un altro fenomeno è la comparsa di inclusioni di amido inizialmente nella zona subapicale e successivamente diffuse in tutto l espianto. La precoltura induce un significativo aumento di amido nell apice nel corso dei 14 giorni di trattamento in tutte le tesi studiate (fig. 1). Quando le gemme sono state trattate per 30 min con soluzione crioprotettiva (CP) la tendenza dell accumulo di amido continua fino ad un valore di circa 0,03 (area dei granuli di amido/area dell espianto) (fig. 1). Il trattamento con PVS2 determina un ulteriore accumulo di amido quando fatto durare 30 e 60 minuti. Nel trattamento di 90 minuti l incremento si ha solo nelle tesi 0,2M, mentre nelle altre due tesi non si hanno variazioni significative (fig. 1). Dal punto di vista istochimico l amido è presente inizialmente alla base dell apice e successivamente su tutta la superficie dello stesso. Nelle tesi trattate con 0,4M di saccarosio e CP si nota la presenza di basse quantità di granuli di amido, di piccole dimensioni (fig. 3). Fig. 1 - Andamento dell accumulo di amido nella gemma per le diverse concentrazioni di saccarosio nel terreno di precoltura (0,2, 0,3 e 0,4M). Fig. 1 - Trend of starch accumulation in shoot tips for different concentrations of sucrose in pre-culture medium (0.2, 0.3 and 0.4M). 83

3 Fabbri et al. Fig. 2 - Sezione longitudinale di apice disidratato dopo trattamento con PVS2 per 90 minuti (A=amido; C=citoplasma). Fig. 2 - Longitudinal section of dehydrated shoot tip after PVS2 treatment for 90 minutes (A=starch; C=cytoplasm). Fig. 4 - Abnorme rigonfiamento della parete cellulare (gelificazione) dopo trattamento con PVS2 per 90 minuti (G=gelificazione; A=amido). Fig. 4 - Abnormal cell wall swelling (gelification) after PVS2 treatment for 90 minutes (G=gelification; A=starch). Fig. 3 - Distribuzione di granuli di amido nell apice di una gemma trattata con 0,4M di saccarosio. Fig. 3 - Distribution of starch grains in the shoot tip of a bud treated with 0.4M sucrose. Fig. 5 - Malformazione di germoglio rigenerato dopo trattamento con PVS2 per 60 minuti. Fig. 5 - Malformation of a regenerated shoot after PVS2 treatment for 60 minutes. L analisi degli espianti dopo trattamento con PVS2 mostra una disidratazione spinta delle cellule subapicali e in alcuni casi (0,4M + CP + 90 min PVS2) il trattamento ha portato a lisi delle cellule differenziate e forte disidratazione delle cellule meristematiche con gelificazione delle stesse. Quindi, la conseguenza più appariscente di trattamenti crescenti con PVS2 è la gelificazione delle pareti, che si manifesta con un abnorme ispessimento che non viene colorato dai coloranti utilizzati (fig. 4). L intensità del fenomeno appare legata al tempo di contatto col PVS2, ed è indipendente dalla concentrazione del mezzo in precoltura; con trattamento di 30 minuti la gelificazione è minima o assente e tende ad intensificarsi all au- 84 mentare del tempo di contatto. Infatti, nelle tesi con 90 min di trattamento con PVS2 la gelificazione interessa l intera area della gemma, mentre a 30 min questo fenomeno non si manifesta o è limitato a poche cellule (fig. 2). Nelle tesi con tempo di contatto con PVS2 di 60 min si nota una situazione intermedia. Il fenomeno della gelificazione può essere correlato alla percentuale di rigenerazione ottenuta dopo trattamento con PVS2 (dati non mostrati). Infatti, gli espianti trattati con PVS2 per 90 min non hanno rigenerato alcun germoglio. Invece, il trattamento a 30 e 60 min ha portato ad una rigenerazione rispettivamente di circa il 60 e il 20%; inoltre, le gemme trattate per 30 min con PVS2 hanno prodotto germogli normali,

4 Biodiversità e vivaismo le gemme trattate per 60 min hanno prodotto circa il 45% di gemme malformate (dati non mostrati) (fig. 5). Dopo il trattamento con azoto liquido, e quando la zona meristematica sembra ancora vitale, la gemma è avvolta in uno strato di cellule degenerate e necrotiche, appartenenti alle perule e alla zona subito sottostante alla gemma stessa (fig. 6). Conclusioni I risultati ottenuti in questa ricerca mostrano come il processo di crioconservazione, in gemme di Kober 5BB, dipenda dalla corretta preparazione degli espianti alla fase di congelamento in azoto liquido. Infatti sia la concentrazione del mezzo nella fase di precoltura che il tempo di contatto in PVS2 si sono dimostrati passaggi fondamentali della procedura. In accordo con i risultati di Bagniol et al. (1992) su palma da dattero, dopo il trattamento in terreno arricchito con saccarosio si nota un incremento nella sintesi di amido. Tale incremento si è verificato con tutte le concentrazioni di saccarosio nel terreno di precoltura (fig. 1), e conferma il ruolo fondamentale degli zuccheri nel meccanismo di resistenza alla disidratazione (Levitt, 1980). La mancata rigenerazione degli espianti dopo PVS2 (0.3M+90 min PVS2) potrebbe essere dovuta al fenomeno della gelificazione (fig. 4), che avviene a carico della parete cellulare delle cellule dell apice; le cellule del meristema, una volta completamente gelificate, potrebbero quindi risultare danneggiate in maniera irreversibile. Fig. 6 - Apice, dopo trattamento con azoto liquido, circondato da uno strato di cellule degenerate. Sono presenti abbondanti inclusioni di amido (CD=cellule degenerate; A=amido). Fig. 6 - Shoot tip after liquid nitrogen treatment: the tip is surrounded by a layer of degenerated cells. Starch inclusions are abundant in the meristematic apex (CD=degenerate cells; A=starch). Il fenomeno della gelificazione consiste nell abnorme rigonfiamento della parete che, nel caso di stress da disidratazione, assume un aspetto mucillaginoso per eccessivo assorbimento di acqua (Perotti, 1947). In tali condizioni le pareti costituirebbero un potente ostacolo alla divisione cellulare. Infatti, quando il trattamento è superiore a 30 min il fenomeno causa morte dell espianto (a 90 min di trattamento con PVS2) o malformazioni del nuovo germoglio (a 60 min di trattamento) (fig. 5). Il tempo di contatto con PVS2 appare quindi tossico se superiore a 30 minuti, almeno per le tesi studiate, e questo effetto sembra manifestarsi attraverso gelificazione delle pareti cellulari. Riassunto Gemme di portinnesto di vite Kober 5BB provenienti da micropropagazione sono stati crioconservati mediante tecnica di vitrificazione. Questo processo ha previsto l uso di sostanze crioprotettive, disidratazione mediante soluzione vitrificante, rapido congelamento in azoto liquido e infine rigenerazione. I punti critici del processo sono stati il tempo di contatto degli espianti con il PVS2, che può rivelarsi tossico sugli espianti se esposti per tempi prolungati e la concentrazione di saccarosio nei terreni di precoltura (hardening). Per verificare le condizioni ideali del processo di vitrificazione sono state impostate prove di tossicità, valutando diversi tempi di contatto con la soluzione vitrificante PVS2 (30, 60 e 90 minuti) e diverse concentrazioni di saccarosio nei terreni di precoltura (0,2-0,3-0,4 M). Analisi istologiche sono state condotte per valutare le modificazioni insorte in risposta ai trattamenti e per la localizzazione del danno all interno dalla gemma. Le gemme crioconservate sono state incluse in resina e sezionate al microtomo, e le sezioni sono state colorate con PAS- Amido Black. All aumentare del tempo di contatto con la soluzione vitrificante le cellule periferiche della gemma appaiono degenerate in seguito a plasmolisi, mentre l apice meristematico rimane vitale dopo il processo di crioconservazione. Parole chiave: Conservazione ex situ, vitrificazione, gelificazione, amido, disidratazione. Bibliografia BAGNIOL S., ENGELMANN F., MICHAUX-FERRIÈRRE N., Histocitological study of apices from in vitro plantles date palm (Phoniex dactylifera L.) during a cryopreservation process. Cryo-letters, 13:

5 Fabbri et al. BENELLI C., DE CARLO A., LAMBARDI M., LYNCH P.T., Vitrification of shoot tips, nodal segments and embryogenic tissue of olive (Olea europaea L.) for germplasm cryopreservation. Acta Horticulturae, 560: GALZY R., COMPAN D., Growth and nutrition of grapevine during in vitro long-term storage. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 13: GONZALES-BENITO M.E., PEREZ C., Cryopreservation of Centaurum shoot tips by vitrification. Botanical Gardens Micropropagaion Newsletter, 1, LAMBARDI M., FABBRI A., CACCAVALLE A., Cryopreservation of white poplar (Populus alba L.) by vitrification of in vitro-grown shoot tips. Plant cell Report,19: LEVITT J., Responses of plants to environmental stresses. Vol. 1 Chilling, freezing, and high temperature stresses. Academic press New York. MATSUMOTO T., SAKAI A., Cryopreservation of in vitro-cultured axillary shoot tips of Vitis by vitrification. Acta Horticulturae, 538: MURASHIGE T., SKOOG F., A revised medium for rapid growth and bio assay with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: PEROTTI R., Biologia Vegetale, Vol. I. Rosenberg & Sellier (Torino). PLESSIS P., LEDDET C., DREUDDRE J., Cryopreservation of Vitis vinifera L. cv Chardonnay shoot tips by encapsulationdehydratation: effects of pre-treatment, cooling and postculture conditions. Cryo-Letters, 14: RUZIN S.E., 1999 Plant microtechnique and microscopy. Oxford University Press, New York (USA). TOWILL L.E., 1990 Cryopreservation of isolated mint shoot tips by vitrification. Plant Cell Reports, 9: ZHAO Y., WU Y., ENGELMANN F., ZHOU M., Cryopreservation of auxillary buds of grape (Vitis vinifera L.) in vitro plants. Cryo- Leters, 22: