Trascrizione e maturazione degli RNA

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1 Trascrizione e maturazione degli RNA

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3 L RNA è sisntetizzato a partire dal DNA nel processo della trascrizione L RNA veicola l informazione genica contenuta nel DNA (nucleo) in modo che possa esprimersi : per dare proteine (mrna) funzionare direttamente in attività correlate all espressione genica/sintesi proteica (trna e rrna) svolgere funzioni varie (ribozimi, small RNA, micro RNA, ) Enzima coinvolto: RNA polimerasi DNA-dipendente; un tratto di filamento di DNA ( gene ) funziona da stampo Vengono incorporati nella catena di RNA nascente dei ribonucleosidi attivati in forma trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP) direzione 5 3 prima di niziare la trascrizione l RNA polimerasi riconosce e lega un sito del DNA: promotore

4 Trascrizione nei procarioti 5 P 3 OH RNA polimerasi Ribonucleosidi 5 -trifosfati Ponti fosfodiesterici PPi Unità di trascriz. stampo E. senso RNA polimerasi oloenzima (core + σ) L una o l altra delle 2 semieliche core 2 α 1 β 1 β Si aggiunge σ che riconosce un sito a monte dell inizio della trascr. 2 sequenze consenso Riconosce promotore 1 localizz. 35 nucleot. prima del sito di inizio (-35) Sequenze comuni a più geni 1 a (- 10) Ricca di A T Sito di apertura doppia elica Pribnow box

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6 La polimerasi avanzando sul DNA inserisce nucleotidi complementari allo stampo (DNA ss) sulla catena nascente di RNA (direzione 5 3 ) La doppia elica DNA si riforma a valle della RNA polimerasi (regione ibrida RNA-DNA limitata a pochi nucleotidi) L RNA resta associato all enzima durante tutta la trascrizione

7 Nei batteri la RNA polimerasi è di un solo tipo ed è formata da varie subunità proteiche Il riconoscimento del promotore è mediato dalla subunità σ Il promotore presenta sequenze conservate (consenso) a 35 e -10 bp dal sito di inizio di trascrizione

8 Fasi della trascrizione procariotica Riconoscimento del promotore Inizio trascrizione ed allungamento Terminazione determinata da fattore ρ dissociazione dell enzima dallo stampo e dall mrna Nei batteri gli mrna possono essere policistronici: portano informazione per più polipetidi (o rrna o trna9) sullo stesso trascritto

9 ..trascrizione nei procarioti Trascriz veloce nei tratti: (DNA) A U (RNA) (DNA) T A (RNA) Termine trascrizione Sequenze palindrome compl. ATCG CGAT TAGC GCTA Simmetria bipartita 2 tipi di terminazione spontanea Dipendente da proteina ρ

10 La terminazione può essere indotta da strutture stem and loop che rallentano la RNA pol In alcuni casi terminazione indipendente da fattore rho

11 A volte l RNA pol ha bisogno di un attivatore per potersi legare al promotore

12 Maturazione dei trascritti procariotici mrna maturazione quasi assente traduzione contemporanea a trascrizione (solo in Archea fenomeni di splicing) trna e rrna maturazione mediante taglio di precursori

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14 Segmento 5 non tradotto (da ~10 a più di 200 nucleotidi) Sequenza codificante tradotta Segmento 3 non tradotto (da ~50 a più di 200 nucleotidi) Regola la stabilità dei messaggeri cap. AUG T... AAUAAA... Coda di poli(a) OH Il CAP 5 : Codon di inizio 1. Facilità la fase di inizio 2. E un segnale riconosciuto dai complessi del poro 3. Protegge gli mrna dalle ribonucleasi Codon di terminazione (UGA, UAA o UAG (da ~30 a più di 200 nucleotidi) Complessata con una proteina che è vitale per la cellula. Caratteristiche strutturali di un mrna eucariotico. La coda di poli(a) non è presente in alcuni mrna eucariotici; la struttura cap 5 non è presente in alcuni mrna di virus che infettano cellule eucariotiche.

15 Gene (DNA :doppio filamento) introni AAUAAA NUCLEO Promotore Inizio trascriz. (RNA polimerasi) esoni Sequenza di poliadenilazione Trascritto nucleare (pre-mrna, a singolo filamento CAPPING: aggiunta di 7-metil guanosina 5 3 Splicing: AAAAAA Poliadenilazione: aggiunta di molti residui A RNA messaggero 5 Leader 3 AAAAAA..A Poly A Trailer CITOPLASMA 5 3 AAAAAA..A Traduzione Polisoma Proteina nascente

16 Negli eucarioti l apparato di trascrizione è + complesso 3 enzimi che riconoscono promotori diversi e sintetizzano classi diverse di RNA

17 RNA pol II è formata da un core (con attività polimerasica ) e da varie subunità che agiscono di concerto per riconoscere il promotore, legare il DNA e srotolarlo. Sul promotore viene riconosciuta in particolare la seq TATA box Altre sequenze a monte (anche 200 nt al 5 ) possono attivare o inibire la RNA pol mediante interazione con coattivatori o corepressori Altre sequenze ancora più a monte possono attivare/inibire trascrizone (enhancer)

18 Es: il coattivatore CBP induce la trascrizione di tutti i geni con seq attivatrice CREB ( camp responsive element) Trascrizione di geni controllata da livelli intracellulari di camp

19 Terminazione di trascrizione RNA pol II ed altri fattori tagliano l mrna a valle del sito di poliadenialzione rilascio dell mrna, degradazione del segmento di RNA 3 e dissociazione di RNA pol II dallo stampo

20 Maturazione dei trascritti eucariotici trascritto primario o pre-mrna (hnrna) Capping Metilazione Poliadenilazione Splicing Editing NUCLEO mrna maturo

21 La maturazione degli RNA è cotrascrizionale

22 Capping L aggiunta del CAP di metil guanosina (GMP) al 5 P dell mrna ne protegge l estremità evitando degradazione da parte di ribonucleasi e lo posiziona correttamente sul ribosoma durante traduzione

23 Poliadenilazione aggiunta di adenosine (AMP) al 3 OH dell mrna Stabilizza l RNAm La poliadenilazione avviene a valle di sequenza specifica riconosciuta da vari fattori, subito dopo il taglio che termina trascrizione

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27 Splicing Rimozione di sequenze prive di significato (non codificanti) o introni e risaldatura degli esoni I componenti dello splicesoma riconoscono siti di giunzione esone/introne/esone Tagliano al 5 per dare struttura a cappio (lariat) Taglio al 3 dell introne eliminazione e risaldatura tra i 2 esoni Splicesoma = complesso di proteine e snrna snrnp: small nuclear ribonucleoprotein particle probabilmente ribozimi NB in alcuni casi si ha self-splicing introne è ribozima

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29 Esperimenti di associazione DNA-mRNA indicano la presenza di introni

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31 RNA Editing Cambiamento nella seq dell mrna a livello post-trascrizionale: aggiunta-delezione di nt o cambiamento di basi azotate (U C) Tipico di geni mitocondriali e di cloroplasti Richiede stampi di RNA guida (grna) originati da introni Es editing tessuto specifico del mrna per apoliporoteinab (ApoB) Solo gli mrna maturi lasciano il nucleo

32 Maturazione degli rrna eucariotici rrna 28S, 18S, 5,8S derivano da singolo precursore trascritto da RNA pol I gene ripetuto in tandem centinaia di volte nella zona NOR zona fibrillare del nucleolo, attivamente trascritta in alcune fasi della vita cellulare rrna 5S invece trascritto da RNA pol III cluster di geni ripetuti fuori dal nucleolo e diverso precursore

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35 Maturazione del precursore di rrna 28S, 18S, 5,8S Modificazione di nucleotidi (metilazione e sostituzione di U con Ψ) mediata da snorna Associazione con proteine ribosomali eliminazione degli spaziatori intragenici

36 Maturazione dei trna eucariotici Trascritti da RNA pol III che riconosce promotore interno al gene (su tratto codificante) geni organizzati in cluster Precursori con geni singoli sono accorciati al 5 e 3, subiscono modificazione di basi ed eventuale splicing La maturazione dei pretrna coinvolge il ribozima RNasiP

37 L esportatore del t-rna dal nucleo verso il citoplasma è l esportina-t. Si lega pref. ai trna maturi, aiutando così a garantire che i trna non maturi non siano esportati prematuramente. Addirittura i trna vendono legati all Aa direttamente nel nucleo

38 CONCETTO DI GENE anni 40: esperimenti di Beadle & Tatum Si determina la relazione tra geni ed enzimi grazie a ricerche su alcuni ceppi della muffa del pane (NEUROSPORA ) definiti «mutanti nutrizionali». ALTERAZIONE DNA DIFETTO PROTEINA DIFETTO DI CRESCITA Un gene un enzima Un gene un polipeptide

39 Sono possibili varie definizione di gene!! 1) Il gene è una sequenza di DNA contenente l istruzione per la produzione di un polipeptide (fornisce cioè le istruzioni per la sintesi proteica). (questa definizione non tiene conto dei geni per trna e rrna) 2) Il gene è un unità trascrizionale (questa definizione esclude le seq regolatrici e la possibilità che gene dia più prodotti mediante splicing e/o inizi/fine di trascrizione alternativi) 3) Gene: segmento di DNA contenente un informazione, non sempre univoca 4) Gene: unità ereditaria promotore e regioni regolative, tratto codificante, terminatore di trascrizione Elementi fondamentali di un gene: Negli eucarioti il tratto codificante è interrotto da introni!! genomi +ampi Nei procarioti + geni sono trascritti insieme ( mrna policistronici)

40 The sequence of a eukaryotic protein-coding gene is typically not colinear with the translated mrna; that is, the transcript of the gene is a molecule that must be processed to remove extra sequences (introns) before it is translated into the polypeptide. The sequence of a prokaryotic proteincoding gene is colinear with the translated mrna; that is, the transcript of the gene is the molecule that is translated into the polypeptide.

41 Il codice genetico Il flusso d informazione si basa su un codice a triplette di basi: CODONI le istruzioni che specificano la sequenza di amminoacidi di un polipeptide sono scritte nel DNA (e sull mrna) come codoni Il codice genetico è universale! Quasi tutti gli organismi (dai batteri alle piante agli animali) condividono lo stesso codice genetico. Prima base azotata U C A G UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Seconda base azotata U C A G Phe Leu Leu Ile Met o inizio Val UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACC GCU GCC GCA GCG Ser Pro Thr Ala UAU UAC UAA Stop UAG Stop CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Tyr His Gln Asn Lys Asp Glu UGU UGC UGA Stop UGG Trp CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Cys Arg Ser Arg Gly U C A G U C A G U C A G U C A G Terza base azotata