PRODA Istituto di Diagnostica Clinica

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1 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Informazioni sull analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi prenatale Che cos è la Fibrosi cistica. La fibrosi cistica è una malattia ereditaria, cronica, evolutiva, caratterizzata dalla produzione di muco particolarmente denso, viscoso, che tende ad ostruire i bronchi ed i dotti del pancreas. Un bambino ogni circa nasce con questa malattia. La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, danneggiando l apparato respiratorio (con presenza di tosse persistente, bronchiti ricorrenti, sinusite, poliposi nasale) e disturbi digestivi (con difficoltà nella crescita). Inoltre, negli uomini si manifesta sterilità di tipo ostruttivo e nelle donne una riduzione della fertilità. A volte possono essere presenti anche ostruzione intestinale alla nascita, diabete ed alterazioni del fegato. La fibrosi cistica, in individui diversi, può esprimersi con maggiore o minore gravità, viene pertanto trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, con antibiotici, aerosol-terapia, estratti pancreatici e vitamine, fisioterapia. Nonostante che il decorso e la prognosi della fibrosi cistica siano notevolmente migliorati negli ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente, allo stato attuale non si ottiene la guarigione e la durata media della vita è ridotta rispetto a quella della popolazione generale. Come si trasmette la malattia. La fibrosi cistica è determinata da alterazioni, chiamate mutazioni, a livello di una specifica coppia di geni, definiti CFTR. I geni sono sequenze di una sostanza chimica complessa, chiamata DNA, e vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Ogni persona eredita complessivamente oltre coppie di geni dai suoi genitori. In un malato di fibrosi cistica entrambi i geni CFTR sono difettosi. Viceversa, un portatore di fibrosi cistica è un individuo sano che possiede un gene difettoso ed un gene normale. I portatori di fibrosi cistica sono circa il 4% della popolazione, cioè una persona ogni 25 circa è portatrice. Una coppia costituita da due portatori ha ad ogni gravidanza un rischio del 25% di generare un figlio malato (se vengono trasmessi entrambi i geni alterati), ed una probabilità del 75% di generare un figlio sano, che può essere portatore o non portatore. Come si esegue l analisi genetica. Per eseguire l analisi genetica è necessario il prelievo di un campione di sangue. Dalle cellule del sangue viene estratto il DNA, e su questo si esegue l analisi molecolare per la ricerca di un eventuale mutazione nella coppia di geni della fibrosi cistica. L analisi fornisce informazioni solo riguardo alla fibrosi cistica. Le mutazioni possibili sono numerosissime (~1200), molte di esse sono rare, molte altre ancora sconosciute e non tutte ancora identificabili. L analisi genetica normalmente ricerca le 36 mutazioni più frequenti. 1

2 Materiali e metodi utilizzati La tecnica adottata per l analisi delle 36 mutazioni più frequenti del gene CFTR nella popolazione italiana, utilizza 19 coppie di primers che amplificano tratti di DNA ove sono localizzate le mutazioni stesse, combinate in 2 multiplex PCR. La presenza o l assenza delle mutazioni viene valutata mediante ibridazione inversa non radioattiva (LiPA - Line Probe Assay). Di seguito è riportato l elenco delle 36 mutazioni per le quali si effettua la ricerca: E60X A455E Q552X 3905insT G85E ΔF AA>G W1282X 394delTT ΔI delA S1251N 621+1G>T 3199del6 2143delT N1303K R117H G542X G>A CFTRdele2,3(21Kb) 711+5G>A G>A R1162X 711+1G>T 1078delT G551D 3659delC A>G R347P R553X G>A G>A R334W R560T KbC>T I148T Le mutazioni sopra indicate costituiscono il 73% delle mutazioni presenti nella popolazione italiana. La capacità di rilevazione di mutazioni del gene CFTR con il test usato (comparata con la percentuale di rilevazione considerando tutte le mutazioni del gene CFTR fino ad oggi evidenziate nella popolazione italiana) è superiore al 94% (Rendine et al, 1997; Bombieri e Pignatti, 2001). Il test è da considerarsi altamente specifico e non sono state evidenziate cross-reazioni con mutazioni rare o polimorfismi in prossimità delle posizioni delle sonde utilizzate. Quali risultati può dare l analisi genetica e che implicazioni comporta per la gravidanza Nel caso di richiesta di analisi molecolare per Fibrosi Cistica in gravidanza, il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate, viene valutata la necessità di effettuare la diagnosi prenatale molecolare (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto;vedi oltre). Con l attuale analisi si possono avere due tipi di risultati: - l analisi individua nel DNA la presenza di una mutazione del gene CFTR (soggetto positivo al test): questo risultato evidenzia che il soggetto è un portatore; - l analisi non individua la presenza di mutazioni del gene della fibrosi cistica (soggetto negativo al test): questo risultato evidenzia che il soggetto ha una probabilità diminuita, rispetto a prima dell analisi, di essere un portatore ( 1%). Non è possibile che l analisi escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perché non è possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica. Ciò implica che: - se entrambi i membri di una coppia sono negativi al test, la probabilità di avere un figlio affetto è inferiore a quello della popolazione generale (1 probabilità su ); - se entrambi risultano positivi al test (entrambi portatori), il rischio di avere un figlio affetto è pari al 25% (1 probabilità su 4) ad ogni gravidanza. In questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto; 2

3 - se un genitore è positivo al test (portatore) e l altro è negativo, il rischio di avere un figlio affetto è superiore a quello della popolazione generale (cioè 1 probabilità su 400). In questa circostanza la diagnosi molecolare prenatale (test di esclusione fetale) permette di escludere la malattia nel feto solo nel 50% dei casi; mentre negli altri casi, la mancata esclusione raddoppia il rischio di malattia nel feto (1 su 200). In questi casi è possibile fare ricorso anche ad indagini prenatali di altra natura per ottenere una migliore definizione del rischio, mentre tecniche più complesse di analisi molecolare per la ricerca di mutazioni per la fibrosi cistica (eseguibili preferibilmente in fase preconcezionale come analisi di II livello - DDGE, DHPLC, sequenziamento- e valutate comunque in un colloquio specialistico di consulenza genetica), richiedono tempi lunghi di esecuzione e costi elevati e, comunque, non arrivano mai ad escludere la presenza di mutazioni (sensibilità non assoluta, difficoltà nell interpretare varianti di sequenza dalle incerte conseguenze cliniche). Problematiche e limiti dell analisi genetica molecolare Le analisi genetiche molecolari sono indagini di recente sviluppo, continuamente sottoposte a revisione e perfezionamento. E possibile che per la complessità delle procedure tecniche utilizzate, in una percentuale molto bassa di casi (inferiore all 1%), il test genetico per fibrosi cistica vada ripetuto o fornisca un risultato inesatto. E importante ricordare che: La probabilità di trovare una mutazione (e quindi di ricevere la diagnosi di portatore di fibrosi cistica) è maggiore per un soggetto che sappia di avere nella sua famiglia una persona affetta dalla malattia o un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la mutazione nella persona malata o del portatore presente in famiglia (mutazione famigliare ) e poi ricercarla nella persona interessata all analisi; Se un individuo, imparentato con un malato al quale non è stato possibile identificare la mutazione familiare, chiede l analisi genetica; o nel caso di diagnosi prenatale uno dei due genitori è portatore di una mutazione non identificabile, è necessario ricorrere ad indagini più complesse che coinvolgono oltre al malato altri familiari. Quest ultime (analisi indiretta mediante marcatori polimorfici, ovvero sequenze diverse, ma normali, di DNA ereditabili in associazione al gene CFTR) comportano un moderato aumento di rischio di errore e non sempre possono fornire un risultato. Quando siano coinvolti più familiari, se i legami di parentela di coloro che si sottopongono al test sono diversi da quanto dichiarato, il test può rivelare tale situazione (ad esempio quando il padre anagrafico non sia quello biologico), oppure può fornire un risultato sbagliato. Una diagnosi sbagliata in un membro di una famiglia può portare ad altri errori diagnostici per altri soggetti di quella famiglia. Il risultato dell analisi genetica può condurre a fare diagnosi non solo di portatore, ma anche di malato di fibrosi cistica, qualora nel soggetto analizzato vengano individuate non una, ma due mutazioni del gene della fibrosi cistica. Il risultato dell analisi genetica può condurre a considerare l eventualità di una diagnosi prenatale. E importante ricordare che casi eccezionali di fibrosi cistica potrebbero essere dovuti a mutazioni de novo, alleli complessi (combinazioni di più polimorfismi diversi in grado di influenzare la funzionalità del gene), disomia uniparentale. Nell 1% dei pazienti con fibrosi cistica tipica eterogeneità genetica (coinvolgimento di geni diversi dal CFTR) non può essere esclusa. 3

4 E importante sottolineare che: in rari casi un risultato non interpretabile può evidenziarsi a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3 dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari. e possibile che siano presenti altre mutazioni ma, che non essendo incluse nel kit, non siano rilevabili il test LiPA non è in grado di rilevare se le 2 mutazioni di un paziente eterozigote composto siano presenti su uno o 2 cromosomi (in cis o in trans). Solo lo studio del DNA parentale potrà dare indicazioni sulla fase cromosomica. In considerazione delle problematiche sopra esposte, in concomitanza del test genetico viene sempre offerta una consulenza genetica. I risultati ottenuti con l analisi del DNA sono strettamente confidenziali; potranno essere comunicati ad altre persone solo dopo autorizzazione dell interessato. Referenti per l analisi genetica per fibrosi cistica Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l analisi molecolare sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l eventuale test molecolare di FC sul feto, sono precedute da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica Medica, che ha la finalità di trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a comprenderne il significato e le implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso informato degli interessati. L analisi molecolare è effettuata presso l Istituto di Diagnostica Clinica PRODA Sezione Citogenetica e Genetica Molecolare. 4

5 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Consenso informato all indagine genetica per fibrosi cistica Ho preso visione delle informazioni allegate, che ho integrato con ulteriori precisazioni fornite dal Dottor.. Avendo compreso il significato e le implicazioni di questa procedura, chiedo di sottopormi all indagine genetica per la ricerca delle più frequenti mutazioni associate alla fibrosi cistica. La mia richiesta di sottopormi al test è completamente volontaria. Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al Laboratorio. Sono consapevole che raramente l analisi può fornire un risultato errato ma che, comunque, la probabilità di un errore diagnostico è inferiore all 1%. In rarissimi casi può evidenziarsi un risultato non interpretabile a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3 dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari. Sono consapevole che nel caso di richiesta di analisi molecolare per FC in gravidanza il test viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l eventuale stato di portatore per ognuno dei genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle mutazioni ricercate, viene effettuata la diagnosi prenatale molecolare per FC (diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto). Sono, inoltre, consapevole che, per una corretta e completa interpretazione conclusiva, sarà opportuno esibire, al Medico che ha prescritto l esame, il risultato del test consegnatomi dal Laboratorio. Dati anagrafici del paziente Cognome: Nome: Data e luogo di nascita Indirizzo: Recapito telefonico: Roma, Firma del paziente Firma del Medico che ha raccolto il consenso 5